Klonowanie i ekspresja

wektory ekspresji białek

Plazmidy lub wektory ekspresji białek to koliste fragmenty DNA, które zawierają liczne elementy funkcjonalne do klonowania i ekspresji interesującego białka. Wybór odpowiedniego wektora ekspresji jest częściowo zdeterminowany przez rodzaj białka, organizm, który będzie wyrażał białko, oraz konkretne zastosowanie i pytania naukowe, na które badacz chce odpowiedzieć. Szeroka gama dostępnych wektorów ekspresji pozwala badaczom wybrać, które elementy klonowania, selekcji klonów i ekspresji białek są najlepsze dla ich badań. Po wybraniu interesującej sekwencji genu i wektora ekspresji, badacze zwykle używają nukleaz do precyzyjnego cięcia wektora w określonych miejscach, aby umożliwić klonowanie interesującej sekwencji genetycznej w ramce i ostatecznie ekspresję w organizmie gospodarza. Co ważne, naukowcy powszechnie wykorzystują chemicznie kompetentne komórki i transformację bakteryjną do hostowania rekombinowanych plazmidów DNA, ponieważ są one stabilne, gdy są przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -70 °C.

Jak transfekować komórki

Transfekcja komórek odnosi się do procesu wprowadzania DNA lub RNA lub białek do komórek eukariotycznych. Naukowcy mają do dyspozycji szereg technologii fizycznych, chemicznych i biologicznych, aby zrealizować tę część procesu ekspresji białek. Metody fizyczne, takie jak elektroporacja lub metody chemiczne, w tym fosforan wapnia (CaPi), polietylenimina (PEI) i odczynniki do lipofekcji są powszechnie stosowane przez naukowców. Naukowcy mają również do dyspozycji systemy transdukcji wirusowej, w tym lentiwirusowe, onkoretrowirusowe i adenowirusowe. Jednak stosowanie metod dostarczania wirusów często wymaga dodatkowego zabezpieczenia i monitorowania ze względów bezpieczeństwa biologicznego.

Systemy ekspresji białek

Naukowcy wykorzystują różne organizmy do ekspresji interesujących ich białek. Bakterie są powszechnie wykorzystywane przez naukowców, ponieważ skutecznie pobierają wektory ekspresyjne, mają szybki czas podwojenia i mogą wytwarzać duże ilości rekombinowanego białka w optymalnych warunkach. Jednakże, ponieważ bakterie są organizmami prokariotycznymi, nie są w stanie zapewnić modyfikacji potranslacyjnych białek, których wymagają niektóre białka. Komórki eukariotyczne, w tym drożdże i linie komórkowe ssaków, ułatwiają modyfikacje potranslacyjne białek i są również powszechnie stosowane przez naukowców. Wybór najlepszej linii komórkowej do ekspresji białek rekombinowanych i strategii ekspresji białek zależy w dużej mierze od konkretnych potrzeb aplikacyjnych i pytań, na które naukowiec chce odpowiedzieć.