Protokół ligacji DNA

 

Opis produktu
Dostarczone odczynniki
Środki ostrożności i zastrzeżenia
Przechowywanie
Procedura
Materiały
Referencje

Opis produktu

Jednym z najważniejszych etapów procesu klonowania jest ligacja liniowego DNA do wektora klonującego. Ta zdolność do łączenia fragmentów DNA za pomocą technologii rekombinacji jest niezbędna do wielu podstawowych eksperymentów w biotechnologii. Przykłady obejmują ekspresję białek, mutagenezę, analizę genów i zależności struktura-funkcja. Ligację DNA przeprowadza się poprzez inkubację fragmentów DNA z odpowiednio zlinearyzowanymi wektorami do klonowania w obecności buforu, ATP i ligazy DNA.

Zestaw do ligacji DNA zawiera odczynniki niezbędne do zwiększenia spójności ligacji. Zestaw ten zawiera ligazę DNA T4, enzym wybierany do praktycznie wszystkich celów klonowania ze względu na jego zdolność do ligacji zarówno spójnych, jak i tępo zakończonych nici DNA. Zestaw zawiera również glikol polietylenowy (PEG) 8000, który wzmacnia tępo zakończoną ligację poprzez stłoczenie makrocząsteczek. Kontrola ligacji DNA jest dołączona jako kontrola systemu. Zestaw do ligacji DNA jest przetestowany pod kątem zastosowania i nie zawiera wykrywalnej aktywności DNazy.

Wiele parametrów wpływa na ligację, takich jak względny stosunek wstawki do wektora, jakość i rodzaj końców DNA, temperatura ligacji i stężenie DNA. Każdy z tych czynników musi być wzięty pod uwagę w celu udanej ligacji.

Dostarczone odczynniki

Zestaw do ligacji DNA (nr produktu LIGI) zawiera wystarczającą ilość na 150 reakcji

.

10X Ligation Buffer, Nr produktu D2176 250 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolu	300 µL
T4 DNA Ligase, Nr produktu. D2886 4 U/µL w 50% glicerolu zawierającym 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM ditiotreitolu	3 x 100 jednostek
10 mM ATP, Nr produktu. A3702	3 x 100 µL
Control DNA, pBR322 DNA, HAE III Digest, Nr produktu D9430, 0.5 µg/µL w 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA	50 µL
24% (w/v) PEG Solution, Product No. P2454	1,5 mL
Water, Molecular Biology Grade, Product No. W4502	1,5 mL

Wymagane dodatkowe odczynniki 

Wektorowe DNA (0,033-1 µg/µL)
Fragment DNA do wprowadzenia (0,033-1 µg/µL)
Probówki do mikrowirówki, 0,5 mL i 1.5 mL
Może być również wymagana niskotemperaturowa łaźnia wodna

Skróty

ATP = Adenozyno-5'-trifosforan
PEG = Glikol polietylenowy 8000
DTT = Ditiotreitol
EDTA = kwas etylenodiaminotetraoctowy

Precautions and Disclaimer

Zestaw do ligacji DNA jest przeznaczony wyłącznie do użytku laboratoryjnego. Nie jest przeznaczony do narkotyków, użytku domowego ani innych zastosowań. Zestaw zawiera niebezpieczne składniki. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej.

Przechowywanie

Przechowywać w temperaturze -20 °C

Procedura

1. Wyjmij odczynniki zestawu z zamrażarki i umieść na łaźni lodowej w celu powolnego rozmrożenia. Nie wyjmuj ligazy z temperatury -20 °C, dopóki nie będzie potrzebna.
   
   
2. Określ stosunek wstawionego DNA do plazmidowego DNA. Dla większości zastosowań klonowania, stosunek molowy insertu do plazmidu powinien wynosić od 1 do 3. Aby osiągnąć maksymalną wydajność ligacji, zaleca się przeprowadzenie serii reakcji ligacji, zmieniając stosunek wstawionego DNA do plazmidowego DNA. (Patrz Uwagi 1 i 7).
   
   
3. Przygotuj 10 µL mieszaniny reakcyjnej łącząc następujące odczynniki:
   
   0.02-1 µg    DNA wektora (patrz uwagi 1, 6 i 7)
            X µg    Insert DNA (patrz uwagi 1 i 7)
          1 µL   10X Ligation Buffer
        1 µL   10 mM roztwór ATP
           X µL     Woda do objętości 10 µL
   
   Dobrze wymieszać i rozpocząć reakcję dodając
     0.5-2 µL   Ligazę DNA T4 (patrz uwaga 3)
        10 µL    Objętość całkowita
   
   Do ligacji tępo zakończonego DNA dodać 24% glikol polietylenowy do stężenia 15%, zmniejszyć stężenie ATP do 0.5 mM i dodać 10-krotny lub większy nadmiar ligazy T4.¹,² Dodanie PEG pozwala również na bardziej wydajną ligację niższych stężeń kohezyjnie zakończonego DNA (Uwaga 4).
   
   
4. Aby ocenić tło spowodowane niekompletną restrykcją lub defosforylacją, należy uwzględnić dwie negatywne reakcje kontrolne, jedną bez dodanej ligazy i jedną bez dodanej wstawki (patrz Uwaga 6).
   
   Aby potwierdzić wydajność składników reakcji, należy przygotować pozytywną reakcję ligacji kontrolnej do przeprowadzenia równolegle z reakcją eksperymentalną. Zastąp wektorowe DNA i insercyjne DNA 500 ng (1 µL) kontrolnego DNA i zastąp 5 µL objętości reakcji (wody) 24% glikolem polietylenowym.
   
   
5. Dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 16 °C przez noc (12 do 16 godzin) (patrz uwaga 2).
   
   
6. Po zakończeniu inkubacji umieścić na lodzie lub przechowywać w temperaturze -20 °C. W razie potrzeby inaktywować termicznie w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
   
   
7. Oceń tylko pozytywną reakcję ligacji kontrolnej za pomocą agarozy elektroforezy żelowej.
   
   Przygotować buforowany 1,0% (w/v) 1X TBE (nr produktu. T6400) lub 1X buforowany TAE (Nr produktu T9650) żel agarozowy (Nr produktu. A9539) do elektroforezy.
   
   Dodaj 2 µL roztworu do ładowania żelu (nr produktu. G2526) do mieszaniny reakcji ligacji kontroli pozytywnej. Załadować całą objętość na żel agarozowy. Dla porównania załaduj 0,1-0,2 mg nieligowanego kontrolnego DNA zmieszanego z roztworem do ładowania żelu.
   
   Przeprowadź żel zgodnie ze standardowymi procedurami i wybarw bromkiem etydyny (nr produktu E1510). Produkt ligacji pojawi się jako rozmaz leżący nad największym markerem pBR322 Hae III Digest. Markery oryginalnego trawienia mogą być minimalnie wykrywalne.

Uwagi

1. Optymalny stosunek insertu do wektorowego DNA wynosi zwykle od 2:1 do 10:1. Wyższe stężenia składników reakcji DNA spowodują wyższą szybkość reakcji. Wydajność ligacji zależy również od integralności spójnych końców ligowanych fragmentów.¹
   
   
2. Ligazy DNA T4 są niestabilne w temperaturach powyżej 30 °C. Aktywność enzymatyczna zmniejsza się w niższych temperaturach. Inkubacja przez noc (10 do 16 godzin) w temperaturze 12-16 °C jest skuteczna w najszerszym zakresie zastosowań. Niskie temperatury sprzyjają wyżarzaniu spójnych końców. Jednakże, temperatura pokojowa jest zalecana do ligacji tępych końców. Zazwyczaj niższe temperatury inkubacji są stosowane w połączeniu z dłuższymi czasami inkubacji.¹
   
3. Ostateczne stężenie glicerolu (składnika buforu do przechowywania ligazy) nie może przekraczać 5% w końcowej mieszaninie reakcyjnej.²
   
   
4. Dodanie PEG do mieszaniny reakcyjnej ułatwia ligację tępo zakończonych fragmentów. Pozwala również na ligację niższych stężeń  kohezyjnie zakończonego DNA. W tych warunkach ligacja spójnie zakończonych fragmentów może być stymulowana od 10 do 100 razy przez dodanie PEG do końcowego stężenia 15% w mieszaninie reakcyjnej. Stężenie PEG w mieszaninie reakcyjnej nie powinno przekraczać 15%, ponieważ przy wyższych stężeniach tandemowe konkatemery mogą stać się głównym produktem reakcji. Zaobserwowano również, że ligacja DNA lambda w obecności 12% PEG może prowadzić do powstania dużych konkatemerów, które mogą wytrącać się z reakcji.^1,2
   
   
5. Ligaza DNA T4 nie jest hamowana przez obecność tRNA, ale jest silnie hamowana przez NaCl w stężeniach 150 mM lub większych.
   
6. Kiedy wektor jest trawiony pojedynczą endonukleazą restrykcyjną, może potencjalnie ulec samoligacji. Usunięcie 5'-fosforanów z trawionego wektora przy użyciu fosfatazy alkalicznej (nr produktu P4978) zapobiegnie samoligacji. Wektor pozbawiony fosforylacji będzie ligował tylko do wstawki DNA posiadającej ugrupowania 5'-fosforanowe, tworząc dwa wiązania fosfodiestrowe. Dwa pozostałe wiązania fosfodiestrowe są naprawiane po transformacji wektora:wstawka do kompetentnego gospodarza.
   
   
7. Użyj poniższego wzoru, aby obliczyć stężenie końców (w pikomolach) do ligacji na mg fragmentów DNA:

Referencje

1. F. M. A, ea. 1994. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.. 13.14.1-3.16.11.

2. J. S, ea. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.1.63-1.71.