Wprowadzenie do transfekcji komórek

• Co to jest transfekcja i jak transfekować komórki
• Rodzaje transfekcji
• Transfekcja fosforanem wapnia
• Transfekcja za pomocą liposomów
• Elektroporacja
• Transfekcja wirusowa (Transdukcja wirusowa)
• Wybór odczynnika do transfekcji & Protokoły transfekcji

Co to jest transfekcja i jak transfekować komórki

Transfekcja polega na wprowadzeniu DNA, RNA lub białek do komórek eukariotycznych i jest wykorzystywana w badaniach do badania i modulowania ekspresji genów. W ten sposób techniki transfekcji służą jako narzędzie analityczne, które ułatwia scharakteryzowanie funkcji genetycznych, syntezy białek, wzrostu i rozwoju komórek. Testy transfekcji nie tylko umożliwiają postęp w badaniach komórkowych, ale także usprawniają strategie odkrywania leków. Podobne strategie, takie jak transfekcja wirusowa lub transdukcja wirusowa, wykorzystują cząsteczki lentiwirusowe do wprowadzania obcego materiału do komórek eukariotycznych. Natomiast transformacja bakteryjna to proces horyzontalnego transferu genów, w którym bakterie pobierają obcy materiał genetyczny.

.Rodzaje transfekcji

Istnieje szeroki zakres metod transfekcji, które obejmują techniki fizyczne, chemiczne i biologiczne. Techniki te zazwyczaj obejmują wykorzystanie przejściowych lub stabilnych metod transfekcji w celu włączenia kwasów nukleinowych do komórek.

Przejściowe techniki transfekcji obejmują wprowadzenie DNA do komórek, ale w tej metodzie DNA nie integruje się z chromosomami komórkowymi. Technika ta ułatwia wysoką skuteczność transfekcji, a transkrypty genów mogą być analizowane po okresie 1-4 dni. W przypadku przejściowej ekspresji genów na dużą skalę (TGE) w hodowlach komórek ssaków, nośniki transfekcji, takie jak polietylenimina (PEI) i fosforan wapnia (CaPi) mogą być stosowane. Co więcej, metody TGE na dużą skalę zostały również opracowane przy użyciu komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) przy braku surowicy¹.

Stabilne techniki transfekcji obejmują integrację transfekowanego DNA z chromosomami komórkowymi lub tworzenie episomów. Stabilnie transfekowana komórka może być następnie zidentyfikowana przy użyciu selektywnych markerów, takich jak reduktaza dihydrofolianowa (DHFR), fosfotransferaza higromycyny B (HPH) i deaminaza adenozyny (ADA) wśród kilku innych.

Niektóre z powszechnie stosowanych technik transfekcji obejmują wytrącanie fosforanu wapnia, lipofekcję, elektroporację i dostarczanie wirusów. Dodatkowo, metody te mogą być stosowane w kotransfekcji. Techniki te obejmują jednoczesne dostarczanie dwóch różnych kwasów nukleinowych do tej samej komórki i są często stosowane w celu osiągnięcia stabilnej transfekcji. Metody transfekcji ewoluowały, obejmując kilka nowych metod, takich jak biolistyczne systemy dostarczania, które wykorzystują mikrocząsteczki o dużej prędkości do dostarczania kwasów nukleinowych do komórek oraz protokoły transfekcji in vivo , które ułatwiają ogólnoustrojowe dostarczanie cząsteczek siRNA.

.Transfekcja fosforanem wapnia

Technika transfekcji fosforanem wapnia obejmuje wytrącanie DNA i fosforanu wapnia. Wytrącanie jest ułatwione przez zmieszanie roztworu soli buforowanego HEPES, zawierającego fosforan sodu, z roztworem chlorku wapnia i DNA². Szok glicerolowy jest często stosowany w celu zwiększenia wychwytu DNA w niektórych komórkach.

Chociaż technika ta jest opłacalna i może być stosowana do przejściowej lub stabilnej transfekcji w szerokim zakresie komórek, stosunkowo niewielkie zmiany pH (±0,1) mogą wpływać na wydajność transformacji. Co więcej, konieczne jest utrzymanie spójności odczynników w celu odtworzenia wyników testu. Jednak ta metoda transfekcji nie działa w RPMI lub innych pożywkach o wysokim stężeniu fosforanów.

Transfekcja za pośrednictwem liposomów

Techniki transfekcji za pośrednictwem liposomów (lipofekcji) obejmują wykorzystanie liposomów tworzących kationowe lipidy lub polimery nielipidowe. Przykłady odczynników do transfekcji lipofekcyjnej mogą obejmować DOTMA (chlorek N-[1-(2,3,-dioleyloksy)propylo]-N,N,N-trimetyloamoniowy) i odczynniki do transfekcji X-tremeGENE™, odpowiednie do transfekcji różnych składników DNA, małego RNA i CRISPR/Cas9 do różnych linii komórkowych. Transfekcja lipidów może być również dostosowana do efektywnych kosztowo, jak również wysokowydajnych systemów; jednak te transfekcje są zwykle specyficzne dla typu komórki.

Elektroporacja

Ta technika obejmuje ekspozycję błon komórkowych na impulsy elektryczne o wysokiej intensywności, co powoduje tymczasową destabilizację w niektórych obszarach komórki. Podczas tego przejściowego zdarzenia destabilizacji, błona komórkowa staje się wysoce przepuszczalna i umożliwia wejście różnych egzogennych cząsteczek, w tym DNA⁴.

Elektroporacja jest łatwą, niechemiczną techniką, która może zapewnić wysoką skuteczność transformacji w różnych typach komórek. Chociaż technika ta nie zmienia morfologii i funkcji komórek docelowych, metoda ta może powodować śmierć komórek, jeśli transfekcja nie jest przeprowadzana w optymalnych warunkach.

.Transfekcja wirusowa (Transdukcja wirusowa)

Metoda ta obejmuje wykorzystanie wektorów wirusowych do dostarczania kwasów nukleinowych do komórek. Systemy dostarczania wirusów, takie jak wektory lentiwirusowe, adenowirusowe i oncoretrowirusowe, mogą być stosowane do przenoszenia kwasów nukleinowych, nawet w komórkach trudnych do transfekcji.

Chociaż metody dostarczania wirusów są bardzo wydajne, mogą być dość pracochłonne. Co więcej, większość wirusów wymaga hermetyzacji i starannego monitorowania poziomów bezpieczeństwa biologicznego. Przed wykonaniem transfekcji wirusowej należy również wziąć pod uwagę kilka czynników ograniczających, takich jak lityczny charakter wektorów wirusowych, pakowanie linii komórkowych i specyficzność komórek gospodarza.

Wybór odczynnika do transfekcji & Protokoły transfekcji

Dzięki ewolucji protokołów transfekcji i rosnącej łatwości testów transfekcji, konieczne jest wybranie odpowiedniego odczynnika do transfekcji, aby osiągnąć optymalną wydajność transfekcji.

Podczas rozważania odpowiedniego odczynnika do transfekcji, ważne jest, aby zidentyfikować typ komórek i warunki hodowli dla testu. Rzadkie hodowle komórkowe, neurony i komórki pierwotne są zwykle trudniejsze do transfekcji, a zatem będą wymagały odczynników, które mogą ułatwić transfekcję nawet w trudnych do transfekcji komórkach.

Ponadto, poziomy odczynników i parametry cytotoksyczności powinny być również brane pod uwagę przed wyborem odpowiedniego środka do transfekcji. Idealny odczynnik powinien charakteryzować się niską cytotoksycznością i wysoką wydajnością transfekcji dla wymaganych typów komórek.

Tabela 1 Cechy i zalety naszego portfolio odczynników do transfekcji

Nr produktu.	Nazwa	Opis	Cechy iamp; Benefits
XTG360-RO	X-tremeGENE™ 360 DNA Transfection Reagent	Polimerowy odczynnik do transfekcji do dostarczania DNA, siRNA, miRNA i CRISPR/RNP do wielu linii komórkowych	- Skuteczne dostarczanie siRNA/miRNA, plazmidowego DNA i materiałów CRISPR/Cas9 - Ekspresja rekombinowanych białek z plazmidowego DNA. - Minimalne zmiany w morfologii komórek lub indukowana cytotoksyczność.
XTG9-RO.	X-tremeGENE™ 9 Transfekcja DNA	Nieliposomalny odczynnik wieloskładnikowy	- Osiągnij nowy poziom wydajności transfekcji w komórkach pierwotnych i liniach komórek nowotworowych - Generuj dane istotne fizjologicznie przy użyciu odczynnika o niskim działaniu cytotoksycznym. - Zwiększenie wydajności eksperymentów i umożliwienie oceny celu przy użyciu prostego i spójnego protokołu.
XTGHP-RO	X-tremeGENE™ HP DNA Transfection Reagent	Nieliposomalny odczynnik wieloskładnikowy, wolny od składników pochodzenia zwierzęcego	- Osiągnij nowy poziom wydajności transfekcji w komórkach pierwotnych i liniach komórek nowotworowych - Generuj fizjologicznie istotne dane przy użyciu odczynnika o niskim działaniu cytotoksycznym. - Zwiększenie wydajności eksperymentów i umożliwienie oceny celu przy użyciu prostego i spójnego protokołu.
SITRAN-RO	X-tremeGENE™ siRNA Transfection Reagent	Opatentowana mieszanka lipidów i innych składników, wolna od produktów pochodzenia zwierzęcego.		- Obniżenie ekspresji genów o ponad 90% w wielu różnych typach komórek. - Maksymalizacja elastyczności eksperymentalnej dzięki pojedynczemu odczynnikowi do eksperymentów opartych na siRNA i kotransfekcji. - Niska cytotoksyczność - Możliwość pracy z surowicą lub bez, co pozwala uniknąć zmiany pożywki
NPT01	Zestaw do transfekcji NeuroPorter™	Unikalna formuła zastrzeżonego kationowego lipidu zoptymalizowana pod kątem dostarczania DNA do pierwotnych neuronów, komórek glejowych i hodowanych neuronalnych linii komórkowych z wysoką skutecznością i niską toksycznością Rozwiązuje problemy, takie jak słaba żywotność komórek, niska skuteczność transfekcji i neurodegeneracja	- Zoptymalizowany dla pierwotnych neuronów, komórek glejowych i hodowanych linii komórek nerwowych - Bardzo niska toksyczność bez neurodegeneracji lub wycofania dendrytów - Skuteczne dostarczanie DNA do pierwotnych neuronów, komórek glejowych i hodowanych linii komórek nerwowych - Szybki i łatwy w użyciu - Kompatybilny z protokołami transfekcji w surowicy i bez surowicy /td>
L3287	Odczynnik do transfekcji Escort™ IV	Unikalna formuła zastrzeżonego lipidu polikationowego i neutralnego lipidu nietransfekcyjnego.	- Odpowiedni do stabilnej i przejściowej transfekcji - Zoptymalizowany dla szerokiej gamy linii komórkowych - Niska toksyczność - Kompatybilny z różnymi typami komórek. Niska toksyczność - Kompatybilny zarówno z protokołami transfekcji w surowicy, jak i bez surowicy - Idealny dla komórek owadzich
L3037	Odczynnik do transfekcji Escort™ III	Unikalna formuła zastrzeżonego lipidu polikationowego i neutralnego lipidu nietransfekcyjnego	- Odpowiedni do stabilnej i przejściowej transfekcji - Zoptymalizowany dla szerokiej gamy komórek pierwotnych - Niska toksyczność - Kompatybilny z protokołami transfekcji w surowicy i bez surowicy - Idealny dla komórek PC-12
CAPHOS	Zestaw do transfekcji fosforanem wapnia	Często stosowana metoda wprowadzania DNA do komórek eukariotycznych	-. Nadaje się do przejściowej i stabilnej transfekcji - Powtarzalna dla szerokiego zakresu typów komórek - Szeroko stosowana - Niedroga
DOTAP	DOTAP Liposomal Transfection Reagent	Kationowy związek tworzący liposomy do transfekcji DNA, RNA i innych ujemnie naładowanych cząsteczek do komórek eukariotycznych	- Do 100x bardziej wydajny niż transfekcja fosforanem wapnia i DEAE - - Niższa toksyczność niż w przypadku fosforanu wapnia i DEAE. Niższa toksyczność niż w przypadku transfekcji opartej na fosforanie wapnia i DEAE - Kompatybilność z protokołami transfekcji z użyciem surowicy i bez surowicy - Kompatybilny z protokołami transfekcji in vivo
XTG360-RO	X-tremeGENE™ 360 DNA Transfection Reagent	Uniwersalny odczynnik polimerowy do dostarczania DNA, siRNA, miRNA i CRISPR/RNP do wielu linii komórkowych -  Ekspresja białek rekombinowanych z plazmidowego DNA. -  Minimalne zmiany w morfologii komórek lub indukowana cytotoksyczność.
70967	GeneJuice®&Odczynnik do transfekcji	Nielipidowy odczynnik do transfekcji chemicznej zoptymalizowany pod kątem maksymalnej wydajności transfekcji, łatwości użycia i minimalnej cytotoksyczności na szerokiej gamie komórek ssaczych.	- Wysoce wydajny transfer DNA zarówno dla stabilnych, jak i przejściowych transfekcji - Minimalna toksyczność komórkowa - Kompatybilność zarówno z pożywkami zawierającymi surowicę, jak i bez surowicy - Prosty protokół - nie ma potrzeby zmiany pożywki - Idealny do wysokowydajnej transfekcji w formacie płytek wielodołkowych /td>
72181	293-Free™ Odczynnik do transfekcji	Bezzwierzęcy polikationowy liposomalny odczynnik do transfekcji zoptymalizowany do transfekcji komórek HEK293 hodowanych w zawiesinie.	- Zoptymalizowany do przejściowej transfekcji kultur zawiesinowych HEK 293 - Pochodzący ze źródeł niezwierzęcych - Minimalna toksyczność komórkowa - Protokół łatwo skalowalny.br> - Protokół łatwo skaluje się do produkcji - Kompatybilny zarówno z pożywkami zawierającymi surowicę, jak i bez surowicy - Eliminuje potrzebę zmian pożywki
72622-M	NovaCHOice® Zestaw do transfekcji	Optymalizowany odczynnik do transfekcji opracowany specjalnie do produkcji białek ssaków w komórkach jajnika chomika chińskiego (CHO).	- Zwiększa ekspresję w niektórych preparatach pożywek - Zawiera składniki pochodzenia zwierzęcego - Kompatybilny z wieloma chemicznie zdefiniowanymi preparatami pożywek - Eliminuje potrzebę zmiany pożywki po transfekcji - Zawiera składniki pochodzenia zwierzęcego - Kompatybilny z wieloma chemicznie zdefiniowanymi preparatami pożywek - Eliminuje potrzebę zmiany pożywki po transfekcji. Odpowiedni zarówno do przejściowej, jak i stabilnej transfekcji
71115	Odczynnik do transfekcji siRNA RiboJuice™	Zoptymalizowany, łatwy w użyciu odczynnik do transfekcji siRNA o minimalnej toksyczności.	- Skutecznie dostarcza siRNA do szerokiej gamy linii komórkowych ssaków w celu ukierunkowanej supresji genów - Kompatybilny z GeneJuice® Transfection Reagent do jednoczesnej transfekcji siRNA i plazmidowego DNA - Stosowany do supresji genów w różnych liniach komórkowych
71259	Insect GeneJuice.® Odczynnik do transfekcji	Zastrzeżona formuła liposomowa zoptymalizowana pod kątem maksymalnej wydajności transfekcji komórek owadów Sf9.	- Wyjątkowo niska toksyczność dla komórek - Stosowany zarówno do przejściowych, jak i stabilnych transfekcji w pożywkach zawierających surowicę lub bez surowicy - Stosowany do kotransfekcji plazmidów transferowych z liniowym DNA wirusa do produkcji rekombinowanych bakulowirusów - Idealny do ekspresji białek na dużą skalę w transfekcjach kultur zawiesinowych				- Idealny do ekspresji białek na dużą skalę w transfekcjach kultur zawiesinowych./td>
TR-1003	Odczynnik do infekcji / transfekcji Polybrene	Wysokowydajna metoda transferu genów do komórek ssaków wykorzystująca infekcję wektorami retrowirusowymi.	- Zwiększona skuteczność infekcji retrowirusowej - Stosowany do transferu DNA do różnych typów komórek

Ogólne protokoły

Ogólne protokoły transfekcji fosforanem wapnia i technik lipofekcji przedstawiono poniżej w celach porównawczych. Szczegółowe procedury znajdują się w protokołach specyficznych dla produktu.

Referencje

1. Derouazi M, Girard P, Van Tilborgh F, Iglesias K, Muller N, Bertschinger M, Wurm FM. 2004. Serum-free large-scale transient transfection of CHO cells. Biotechnol. Bioeng.. 87(4):537-545. https://doi.org/10.1002/bit.20161

2. Ravid K, Freshney I. 1998. DNA Transfer to Cultured Cells. Wiley-Liss Inc..

3. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, Northrop JP, Ringold GM, Danielsen M. 1987. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84(21):7413-7417. https://doi.org/10.1073/pnas.84.21.7413

4. Chang DC, Saunders JA, Chassy BM, Sowers AE. 1992. Overview of Electroporation and Electrofusion.1-6. https://doi.org/10.1016/b978-0-08-091727-6.50004-6

5. Ausubel FM. 1995. Short Protocols in Molecular Biology. 3. New York: John Wiley & Sons.