Krzywa zabijania antybiotyków

• Co to jest krzywa zabijania antybiotyków?
• Zalecane stężenia antybiotyków dla krzywej zabijania
• Protocol for Kill Curve
• Points to Remember

Co to jest krzywa zabijania antybiotyków?

Krzywa zabijania antybiotyków to eksperyment dawka-odpowiedź, w którym komórki ssaków są poddawane rosnącym ilościom antybiotyku selekcyjnego w celu określenia minimalnego stężenia antybiotyku, które może zabić wszystkie komórki w określonym czasie. Jest to kluczowy krok przed użyciem antybiotyku selekcyjnego do zabicia nietransfekowanych komórek i wygenerowania stabilnych linii komórkowych. Ponieważ każda linia komórkowa ssaków różni się wrażliwością na antybiotyki, zawsze zaleca się przeprowadzenie oddzielnych eksperymentów krzywej zabijania dla różnych linii komórkowych i antybiotyków.

Recommended Concentrations of Antibiotics for a Kill Curve

Poniższa tabela wskazuje zakresy stężeń dla powszechnie stosowanych antybiotyków selekcyjnych, które mogą być stosowane w eksperymentach dawka-odpowiedź.

Dawka-odpowiedź może się różnić w zależności od testowanej linii komórkowej. Zakresy stężeń mają jedynie charakter orientacyjny; krzywą zabijania należy wykonać dla każdego antybiotyku selekcyjnego stosowanego po raz pierwszy lub stosowanego na nowej linii komórkowej.

Tabela 1 Zalecane stężenia antybiotyków selekcyjnych

Wybór antybiotyku	Nr produktu	Zakres
Aktynomycyna D	A9415	5 - 10 µg/ml
Siarczan bleomycyny	B8416	10 - 50 µg/mL
Karbenicylina	C3416	100 - 1000 µg/ml
Chloramfenikol	C3175 C1919	5 - 50 µg/mL
Sól disiarczanowa G 418	A1720 G1279	100 - 800 µg/ml
Roztwór soli disiarczanowej G 418	G8168	100 - 800 µg/ml
Siarczan gentamycyny	G1264	50 - 1000 µg/mL
Roztwór gentamycyny	G1272 G1397 G1522	50 - 1000 µg/mL
Hygromycyna B	H3274 H9773<	200 - 800 µg/ml
Siarczan kanamycyny	K1377	100 - 1000 µg/ml
Roztwór kanamycyny	K0254 K0129	100 - 1000 µg/ml
Mitomycyna C	M4287 M7949 M5353	10 - 100 µg/mL
Kwas mykofenolowy	M3536	25 µg/ml
Trisiarczan neomycyny	N6386 N3144	10 - 100 µg/ml
Roztwór neomycyny	N1142 .	10 - 100 µg/ml
Siarczan norkortycyny	N0186	75 - 100 µg/mL
Siarczan paromomycyny	P8692 P5057	100 - 1000 µg/ml
Puromycyna	P8833	10 - 100 µg/ml
Roztwór piromycyny	P9620.	10 - 100 µg/ml
Rifampicyna	R7382	10 - 50 µg/mL

Protokół dla krzywej zabijania

Następujący protokół przedstawia kroki generowania krzywej zabijania dla komórek.

Co jest potrzebne:

• Linia komórkowa w zdrowym stanie
• Kompletna pożywka hodowlana (pożywka&surowica) zalecana dla danej linii komórkowej
• Wybrany antybiotyk

Kroki:

• Zbierz zdrowe przylegające komórki za pomocą trypsyny lub poprzez delikatne zeskrobanie komórek.
• Rozcieńczyć zawiesinę komórek w kompletnej pożywce i wysiać każdą studzienkę 96-dołkowej płytki tak, aby końcowa objętość wynosiła 100 ul. Zalecana gęstość komórek wynosi ~50% w dniu leczenia.
• Typowa gęstość komórek przed leczeniem antybiotykami w 24-dołkowej płytce:
• 0,8 - 2,5 X 10⁵ komórek/ml komórek przylegających
• 2,5 - 4.5 X 10⁵ komórek/ml komórek zawiesiny
• Inkubować w temperaturze 37 ^oC przez noc lub do momentu, gdy wszystkie komórki będą dobrze dostosowane i zdrowe.

Uwaga: Antybiotyki są najbardziej skuteczne, gdy komórki są w aktywnym podziale; optymalna gęstość komórek jest zatem zalecana dla najdokładniejszej odpowiedzi na dawkę.

Rysunek 1. Schematyczny przewodnik - dobór stężenia antybiotyku.

• Zastąpić pożywkę świeżą pożywką zawierającą różne stężenia antybiotyku selekcyjnego. Utrzymuj każde stężenie w trzech powtórzeniach, jak wskazano w formacie płytki 96-dołkowej (Rysunek 1).
• Wymieniaj pożywkę z antybiotykiem co 48 godzin.
• Hoduj komórki przez 7 - 10 dni regularnie obserwując komórki pod mikroskopem świetlnym. Czas trwania hodowli można wydłużyć do 14 dni w zależności od użytej linii komórkowej.
• W 10 dniu określ żywotność komórek w każdym dołku za pomocą testu MTT lub dokładnego licznika komórek.
• Wybierz stężenie antybiotyku, które całkowicie blokuje wzrost komórek. Użyj tego stężenia we wszystkich eksperymentach transfekcji, aby wybrać odporne, transfekowane komórki, które mogą być dalej hodowane jako stabilne linie komórkowe (Rysunek 2).

Rysunek 2. Próbna krzywa zabijania antybiotyków

Punkty do zapamiętania

• Zachowaj odpowiednie kontrole lub ślepe próby:
  • baseniki zawierające tylko pożywkę z antybiotykiem, bez komórek
  • baseniki zawierające pożywkę i komórki, bez antybiotyku
• Upewnij się, że inkubator jest w idealnym stanie, aby uniknąć parowania pożywki, które mogłoby zwiększyć stężenie antybiotyku, dając fałszywe odczyty./li>

Wybierz odpowiednie antybiotyki dla swoich komórek.

Poznaj całą naszą ofertę antybiotyków do zastosowań badawczych.

Kliknij, aby zapoznać się z całą naszą ofertą w zakresie hodowli komórkowych do zastosowań badawczych.