Udana transdukcja przy użyciu lentiwirusa

Metody i wskazówki dotyczące skutecznego stosowania produktów lentiwirusowych.

Pomyślne ukierunkowanie polega na optymalizacji kluczowych, wrażliwych etapów procesu, w tym transdukcji lentiwirusowej. Poniżej znajduje się kilka pomocnych wskazówek dotyczących obsługi i miareczkowania od naszych ekspertów R&D w dziedzinie lentiwirusów. Jak zawsze, skontaktuj się z naszym wsparciem technicznym, jeśli masz jakiekolwiek pytania dotyczące projektu modyfikacji genomu na CRISPR@sial.com.

• Przegląd protokołu transdukcji lentiwirusowej
   

Definicje kluczowych terminów:

MOI - Multiplicity Of Infection - stosunek liczby transdukujących cząstek lentiwirusowych do liczby komórek.
VP - Viral Particle - pozakomórkowa forma infekcyjna wirusa, składająca się z rdzenia RNA lub DNA wewnątrz otoczki białkowej
TU - Transducing Unit - liczba funkcjonalnych cząstek wirusowych w roztworze, które są zdolne do transdukcji komórki i ekspresji transgenu

.

 

Postępowanie z lentiwirusami:

• Lentiwirusy są wrażliwe na ekstremalne zmiany temperatury. Wielokrotne cykle zamrażania-rozmrażania i przedłużona ekspozycja na temperatury otoczenia zmniejszą funkcjonalne miano lentiwirusa.
  
  
• Rozmrażaj cząsteczki lentiwirusa na mokrym lodzie. Przechowuj je na lodzie podczas wykonywania transdukcji lentiwirusowych.
  
• Lentiwirus powinien być podzielony na mniejsze objętości robocze po pierwszym rozmrożeniu.  Zwróć wszystkie podwielokrotności niewykorzystane w początkowym eksperymencie natychmiast do -70 ° C. Alternatywnie, zamów lentiwirusa w podwielokrotnościach objętości roboczej i rozmrażaj tylko te objętości, które będą potrzebne do transdukcji.
  
• Zanurz cały wirus oraz wszelkie narzędzia techniczne i końcówki, które dotykają wirusa lub komórek zawierających wirusa w 10% wybielaczu przez 20 minut przed wyrzuceniem do odpadów biologicznych.

Zalecenia i kroki w celu optymalizacji konfiguracji eksperymentu

• Otwórz krzywą zabijania dla każdej linii komórkowej, której będziesz używać, aby określić optymalne stężenie antybiotyku potrzebne do selekcji komórek zintegrowanych z lentiwirusem
  
  
• Określ funkcjonalne miano dla każdej linii komórkowej i kombinacji wektorów lentiwirusowych, których będziesz używać (patrz poniżej)
  
  
• Określ wielokrotność infekcji (MOI) dla każdej linii komórkowej i kombinacji wektorów lentiwirusowych, których będziesz używać. MOI to stosunek liczby transdukujących cząstek lentiwirusowych do liczby komórek. Zaleca się, aby dla każdego nowego typu komórek, które mają być transdukowane, przetestować zakres MOI.
  
  
  • Umieść 1,6 x 10⁴ komórek w studzienkach 96-dołkowej płytki z 120 µL świeżej pożywki.
  • Dodaj wirusa kontrolnego do komórek w zakresie MOI. Dla większości typów komórek odpowiedni jest zakres 0,1 - 10 MOI. W przypadku trudnych do transfekcji linii komórkowych może być konieczne zwiększenie zakresu do MOI 50 lub 100.
  • Jeśli używasz selekcji antybiotykowej: zastosuj pożywkę selekcyjną i zidentyfikuj studzienkę z żywymi komórkami przy najniższej testowanej wartości MOI. Jest to MOI do wykorzystania w przyszłych eksperymentach transdukcji dla tej linii komórkowej i wektora
  • Jeśli używasz fluorescencji: zidentyfikuj studzienkę z pożądaną ilościową ekspresją fluoroforu przy najniższej testowanej wartości MOI.
     
• Aby obliczyć ilość wirusa potrzebną po ustaleniu MOI:
  • (całkowita liczba komórek na naczynie lub studzienkę) x (pożądane MOI) = całkowita potrzebna ilość TU
    
  • (całkowita potrzebna ilość TU) / (miano funkcjonalne TU/mL) = całkowita ilość mL cząstek lentiwirusowych do dodania do każdej studzienki

Miareczkowanie cząstek lentiwirusa:

Po przygotowaniu lentiwirusa należy określić jego miano przed transdukcją. Miana wirusów zgłaszane dla naszych produktów lentiwirusowych są określane za pomocą testu p24 ELISA. Ten test mierzy białko kapsydu p24 związane z lentiwirusem.

• Określamy TU/mL na podstawie testu p24 z ZeptoMetrix. Używamy konwersji z Didier Trono w celu określenia związku między pg/mL p24 a mianem wirusa:
  
  
• Znane zmienne:
  1. Istnieje około 2000 cząsteczek białka p24 / fizyczną cząsteczkę (PP) lentiwirusa.
  2. 1 Da = 1 g/mol
  3. Liczba Avogadro = 6 x 10²³ cząsteczek/mol
  4. Masa cząsteczkowa białka p24 wynosi 24 x 10³ Da = 24 x 10³ g/mol
  
  
• Wzór:
  (2000 cząsteczek/PP) ● (24 x 10³ g/mol)= 48 x 10⁶ g ● cząsteczka / PP ● mol
  
  (48 x 10⁶ g ● molekuła / PP ● mol) ÷ (Liczba Avogadro) =
  (48 x 10⁶g ● cząsteczka / PP ● mol) ÷ (6 x 10²³ cząsteczek/mol) = 8 x 10^-17 g/PP
  
  Po zaokrągleniu 8 x 10^-17 g/PP ≃ 1 x 10^-16 g/PP
  
  Przelicz g/PP na pg/PP: (1 x 10^-16 g/PP) ● (1 x 10¹² pg/g) = 1 x 10^-4 pg/PP
  
  Znajdź odwrotność:
  Jeśli 1 x 10^-4 pg = 1 PP; to odwrotność wynosi 1 pg = 1 x 10⁴ PP
  
  Zatem 1 pg białka p24 zawiera w przybliżeniu 10 000 PP<

Wydajność pakowania konstruktu dostarczającego, znanego również jako wektor transferowy, do cząstek lentiwirusowych może się znacznie różnić w zależności od rozmiaru i składu wektora transferowego. Tak więc, dość dobrze zapakowany wektor lentiwirusowy o pseudotypie VSV-G będzie miał zakaźność w zakresie od 1 TU na 200 cząstek wirusowych w przypadku nieefektywnych wektorów transferowych do 1 TU na 1 cząstkę wirusową, gdy wystąpi 100% skuteczne pakowanie wirusów. Ważne jest, aby pamiętać, że pomiar funkcjonalnego miana rekombinowanego lentiwirusa zależy nie tylko od wydajności pakowania wektora transferowego, ale także od wydajności transdukcji zastosowanej linii komórkowej.

• Niestandardowe i gotowe preparaty lentiwirusowe są dostarczane z certyfikatem analizy (C of A), który wskazuje miano p24 w jednostkach transdukujących / ml (TU / ml).
  
• Przy produkcji w formacie 96-dołkowym (mała skala), nasze wektory lenti zostały scharakteryzowane tak, aby dawały od 1x10⁶ do 1x10⁷ TU/mL (mierzone za pomocą testu p24 ELISA).
  
  
• Dostępne są wyższe miana i objętości (duża skala). Dostępne miana mieszczą się w zakresie od 1x10⁷ do 1x10¹⁰ TU/mL (mierzone testem p24 ELISA), a opcje objętości wahają się od 0,1 ml do 10 ml. Uwaga: nie wszystkie opcje objętości są dostępne w najwyższych mianach.
  
  
• Korelacja między p24 a funkcjonalnym mianem jest specyficzna dla wektora i linii komórkowej. Na początku każdego eksperymentu transdukcji należy najpierw określić związek między mianem p24 a mianem funkcjonalnym każdego wektora w linii komórkowej, której będziesz używać. Typowe metody określania miana funkcjonalnego obejmują:
  • Protokół ograniczającego rozcieńczenia w celu wygenerowania jednostek tworzących kolonie (test CFU)
  • Miareczkowanie komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)
  • qRT-PCR
  • Odwiedź Protokoły lentiwirusowe aby uzyskać szczegółowe informacje
     
• Oferujemy różnorodne gotowe kontrole i kontrole wykonane na zamówienie, zaprojektowane w celu optymalizacji konfiguracji eksperymentalnej i określenia związku między mianem p24 a mianem funkcjonalnym. Po określeniu korelacji między p24 a mianem funkcjonalnym dla każdej linii komórkowej i wektora (wektorów), ta sama korelacja może być wykorzystana do pozostałych eksperymentów z tym samym wektorem i linią komórkową.