Bezpieczna obsługa lentiwirusa
Często zadawane pytania i cechy bezpieczeństwa produktów lentiwirusowych
Nasze systemy wektorów lentiwirusowych zostały opracowane ze zwiększonymi cechami bezpieczeństwa. W projekcie naszych lentiwirusów zastosowano liczne środki ostrożności, aby zapobiec replikacji, w tym wyeliminowanie genów wirulencji i rozdzielenie kluczowych genów między różne wektory. Przeczytaj dalej, aby dowiedzieć się więcej na temat często zadawanych pytań dotyczących bezpiecznego użytkowania lentiwirusów.
Aby uczynić lentiwirusy bezpiecznymi, usunięto cztery wirusowe geny pomocnicze, pozostawiając minimalną liczbę genów niezbędnych do wytworzenia cząstek lentiwirusowych pozbawionych replikacji. Zostały one rozdzielone na wiele plazmidów: 3 dla systemów pakowania 2. generacji i 4 dla systemów pakowania 3. generacji. Oznacza to, że 2 lub 3 zdarzenia rekombinacji musiałyby wystąpić jednocześnie, aby wygenerować kompetentne replikacyjnie lentiwirusy.
Vectors for Lentiviral Production
Poniżej odpowiadamy na niektóre powszechne obawy dotyczące bezpieczeństwa lentiwirusów. W przypadku dalszych pytań i dyskusji prosimy o skontaktowanie się z nami.
Rysunek 1. Opakowanie lentiwirusowe.
W celu zwiększenia bezpieczeństwa, geny strukturalne i pomocnicze niezbędne do produkcji cząstek wirusowych są rozdzielone na wiele plazmidów. Wszystkie geny wirulencji i replikacji typu dzikiego są usuwane. Wszystkie lentiwirusowe wektory transferowe firmy Sigma-Aldrich® zawierają zmodyfikowane, samoinaktywujące się powtórzenie terminalne 3' (SIN/LTR), które sprawia, że powstałe cząstki lentiwirusowe nie są zdolne do replikacji. Cząsteczki lentiwirusowe są pakowane w producenckie linie komórkowe, takie jak komórki HEK293T. Po współtransfekcji plazmidów, wszystkie wymagane sekwencje są dostępne do produkcji i pakowania cząsteczki wirusowej zawierającej interesujący nas transgen. Tylko region pomiędzy wirusowymi LTR wektora transferowego jest upakowany w wirusowym kapsydzie.
Jak poważne są obawy związane z bezpieczeństwem biologicznym lentiwirusów? Czy istnieje realne ryzyko zakażenia wirusem HIV?
Systemy wektorów wirusowych zostały opracowane z ulepszonymi funkcjami bezpieczeństwa, jak opisano powyżej. Powstałe cząsteczki są niekompetentne do replikacji, a delecja w części U3 3' LTR eliminuje region promotora-wzmacniacza, dodatkowo negując możliwość replikacji wirusa. System usunął również geny wirulencji, które nie są niezbędne do pakowania wirusa. W połączeniu te cechy poprawiły bezpieczeństwo biologiczne i obsługę. Zaleca się stosowanie wektora transferowego trzeciej generacji ze względu na jego ulepszone funkcje bezpieczeństwa biologicznego. Chociaż nie ma udokumentowanych przypadków wektorów transferowych trzeciej generacji wytwarzających wirusa zdolnego do replikacji, ważne jest, aby monitorować zdolność do replikacji podczas rutynowego pakowania lentiwirusów. Wytyczne NIH zalecają, aby cząstki lentiwirusowe niezdolne do replikacji były traktowane jako grupa ryzyka 2 (RGL2). Dodatkowe środki ostrożności mogą być wymagane w oparciu o przepisy lokalne, stanowe lub krajowe.
Czy lentiwirus może przenikać przez barierę krew-mózg (BBB)?
Biorąc pod uwagę rozmiar cząsteczek i obecny pseudotyp VSV-G, nie oczekuje się, że lentiwirus przejdzie przez BBB (chociaż nie mamy danych na poparcie tego twierdzenia). Wielu badaczy zajmujących się obszarami mózgu wykazało, że optymalne jest bezpośrednie wstrzyknięcie do czaszki.
Czy wektor pLKO.1 jest wektorem opartym na HIV, a jeśli tak, to czy istnieją jakieś kwestie związane z bezpieczeństwem biologicznym?
Wektor pLKO.1 i jego pochodne są plazmidami opartymi na lentiwirusach (HIV). Lentiwirus jest uważany za materiał na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 i jest bezpieczny w użyciu ze względu na jego zmodyfikowane cechy (usunięcie wielu dodatkowych genów wirulencji, minimalny genom cząstek wirusowych, brak replikacji i cechy samoinaktywacji), co czyni go niezdolnym do wytwarzania wirusa po zainfekowaniu komórki gospodarza. Szczegółowe wymagania należy skonsultować z urzędnikiem ds. bezpieczeństwa biologicznego w danej instytucji.
Jak zminimalizować wpływ na środowisko i ryzyko regulacyjne?
Dobre praktyki laboratoryjne są niezbędne, aby zapobiec wszelkim formom zanieczyszczenia, które mogą skutkować możliwością powstania wirusa zdolnego do replikacji. Konieczne jest testowanie wirusów zdolnych do replikacji. Ponieważ geny strukturalne wirusa zostały umieszczone na różnych jednostkach genetycznych, przed wygenerowaniem wirusa pomocniczego zdolnego do replikacji musi wystąpić wiele zdarzeń rekombinacji. Co więcej, obszary homologii między jednostkami wyrażającymi białka wirusa pomocniczego zostały zminimalizowane. Stosowane są również heterologiczne promotory dla białek wirusa pomocniczego. Wytyczne CDC dotyczące praktyk BSL-2 + powinny regulować postępowanie z dużymi ilościami wirusa i skoncentrowanym wirusem. Nasze zakłady produkcyjne Sigma Aldrich rutynowo przeprowadzają znormalizowane procedury w celu przetestowania spontanicznej produkcji lentiwirusa zdolnego do replikacji (RCV). W ciągu ponad dziesięciu lat produkcji na miejscu nigdy nie zaobserwowaliśmy wirusa zdolnego do replikacji; dane dostępne na żądanie.
Co należy zrobić z materiałem, który miał kontakt z lentiwirusem?
Przed wyrzuceniem do odpadów niebezpiecznych biologicznie należy namoczyć wszystkie wirusy i wszelkie narzędzia techniczne oraz końcówki, które dotykają wirusów lub komórek zawierających wirusy, w 10% wybielaczu przez 20 minut. Szczegółowe instrukcje można uzyskać od specjalisty ds. bezpieczeństwa biologicznego w danej instytucji.
Prosimy o skontaktowanie się z nami w przypadku jakichkolwiek innych pytań dotyczących bezpiecznego korzystania z wektorów lentiwirusowych i rozwoju projektu edycji genów.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?