Transformacja E. coli za pomocą zmodyfikowanego plazmidu

• Tworzenie kompetentnych komórek
• Tworzenie płytek agarowych
• Transformacja bakterii
• Picking Colonies
• Freezing Bacteria

Making Competent Cells (Inoue Method)

Inoue i współpracownicy opracowali tę metodę w 1990 roku.Działa ona dobrze w przypadku wielu szczepów powszechnie stosowanych w klonowaniu. Oryginalna metoda wymaga hodowli przez noc E. coli w temperaturze 18°C. Okazuje się, że nadal działa dobrze, jeśli są one hodowane przez noc w temperaturze 37°C. Alternatywnie, można kupić gotowe do użycia chemicznie kompetentne komórki lub komórki elektrokompetentne, w tym BL21 (nr katalogowy  CMC0014) i SIG10 (nr katalogowy  CMC0001). Komercyjnie przygotowane komórki kompetentne mogą być korzystne, ponieważ ich przygotowanie zostało zoptymalizowane, zapewniając wyspecjalizowane komórki o wysokiej wydajności transformacji do unikalnych zastosowań. Zobacz Przewodnik wyboru komórek kompetentnych dla pełnej listy.

Będziesz potrzebować:

DMSO (dimetylosulfotlenek) (Nr kat. D8418)
Płytki LB do posiewu z E. coli
3 x 250 ml SOB (Nr kat. H8032) do hodowli nocnych
Dodatkowy SOB dla kultury starterowej
Inkubator z wytrząsaniem
0.5 M PIPES (kwas piperazyno-1,2-bis[2-etanosulfonowy]) pH 6.7 (Nr kat. P8203)
Bufor do transformacji Inoue
Sterylne probówki do mikrowirówki
Sterylna probówka do wirówki o pojemności co najmniej 250 ml
Wirówka zdolna do odwirowania takiej probówki. Wirówka zdolna do odwirowania takiej probówki z siłą 2500 x g

Protokół produkcji kompetentnych komórek w szoku cieplnym<

Dzień 1

1. Wybierz pojedynczą E. coli kolonię z płytki LB, która była inkubowana przez noc. Zaszczep kolonię kulturą starterową zawierającą 2 ml pożywki SOB w 50 ml probówce i inkubuj ją przez około 7 godzin w temperaturze 37oC z wytrząsaniem.
2. Przygotuj lub rozmroź porcję buforu do transformacji Inoue.
3. Zaszczep trzy kolby zawierające 250 ml pożywki SOB trzema różnymi objętościami kultury starterowej, aby zapewnić, że jedna z nich osiągnie pożądaną OD następnego ranka. Sugerujemy wypróbowanie 10 μl, 50 μl i 250 μl. Inkubuj kolby przez noc w temperaturze 37°C z wytrząsaniem.

Dzień 2

1. Następnego ranka odczytaj OD600 wszystkich trzech kultur. Kontynuuj monitorowanie OD600.
2. Kiedy OD600 jednej z hodowli osiągnie 0,55, przenieś tę hodowlę do lodowatej łaźni wodnej na 10 minut. (Rozpocznij schładzanie mikroprobówek.)
3. Zbierz komórki przez wirowanie przez 10 minut przy 2500 x g i temperaturze 4°C.
4. Zlać supernatant i ponownie delikatnie zawiesić komórki przez pipetowanie w 80 ml lodowatego buforu do transformacji Inoue.
5. Odzyskaj komórki przez wirowanie przez 10 minut przy 2500 x g i temperaturze 4°C.
6. Zlej supernatant i ponownie delikatnie zawieś komórki przez pipetowanie w 10 ml lodowatego buforu do transformacji Inoue.
7. Dodaj 0,75 ml DMSO, wymieszaj przez wirowanie i przechowuj komórki na lodzie przez 10 minut.
8. Dozuj porcje zawiesiny komórkowej o objętości 100 μl do schłodzonych probówek mikrofugowych.
9. Zamrażaj porcje kompetentnych komórek partiami, wrzucając je do ciekłego azotu.

Przechowuj podwielokrotności w zamrażarce o temperaturze -80°C, aż będą potrzebne.

Przygotowanie płytek agarowych

Przepis ten jest przeznaczony do przygotowania około 50-60 płytek agarowych Luria-Bertani (LB) do hodowli E. Coli ze standardowymi plazmidami. Alternatywnie można zakupić wstępnie odmierzony agar LB w formacie EZ-Mix™, nr katalogowy  L7533.

10g Tryptone  (Nr katalog. T2559)
5g ekstraktu drożdżowego (Nr kat. Y1625, Y1626)
10g NaCl (Nr kat. S3014)
15g Agar w proszku (Nr kat. L2897)
Do 1 litra wody

Odmierz powyższe ilości i dodaj do 1 litrowej butelki z dobrze działającą pokrywką (patrz poniżej). Napełnij czystą wodą dejonizowaną (najlepiej co najmniej 18 megaomów). Zakręć pokrywkę i wstrząśnij, aby wymieszać płyn i proszek, nie oczekuj, że wszystko się rozpuści, ale po prostu uwolnij proszek z dna i usuń większe grudki. Niewłaściwie wymieszany proszek może zapiec się na dnie butelki. Odkręć pokrywkę o około pół obrotu; dodaj trochę taśmy do autoklawu, a następnie autoklawuj.

Po autoklawowaniu upewnij się, że pokrywka jest szczelnie zamknięta i nie pozwól, aby ostygła poniżej 45-50 stopni. Agar zazwyczaj zastyga w temperaturze około 40 stopni. Orientacyjnie, jeśli możesz wygodnie trzymać butelkę w dłoni, jest ona gotowa do nalania i może być już zbyt chłodna. Nie dodawaj antybiotyku, gdy agar jest zbyt gorący, może to wpłynąć na stabilność i okres półtrwania antybiotyku, zwłaszcza ampicyliny. Dodaj odpowiednią ilość antybiotyku (patrz poniżej) i wymieszaj przez delikatne wirowanie. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, ponieważ spowoduje to powstawanie bąbelków lub nierówności na płytkach. Wlać około 12-15 ml na płytkę (nr katalogowy  Z617636). Prostą metodą jest ułożenie płytek dużymi częściami (pokrywkami) do góry. Podnieś cały stos do góry za pomocą pokrywy dolnej płytki i drugą ręką wlej agar. Wlej tyle, aby wypełnić dno, a następnie trochę więcej. Następnie odłóż stos z powrotem na dół i podnieś go ponownie, używając kolejnej pokrywy w stosie. Brzmi niekonsekwentnie, ale z czasem jest to bardzo powtarzalne.

Alternatywnie można zakupić gotowe płytki agarowe LB, z antybiotykami lub bez:

Płytki agarowe LB (Nr katalogowy. L5542)
Płytki agarowe LB z ampicyliną (Nr katalog. L5667)
Płytki agarowe LB z kanamycyną (Nr kat. L0543)
Płytki agarowe LB z karbenicyliną (Nr kat. L0418)
Płytki agarowe LB z tetracykliną (Nr kat. L8795)

Wskazówka 1: Wiele butelek laboratoryjnych ma niebieską lub przezroczystą plastikową obwódkę, która może zaginąć lub zostać spalona przez płomień. Te niebieskie obręcze zapobiegają spływaniu agaru po butelce podczas nalewania płytek i utrzymują szczelne zamknięcie po autoklawowaniu. Upewnij się, że obręcz jest nienaruszona.

Wskazówka 2: 1 litr to dość dużo agaru i antybiotyku, zmniejsz przepis, aby dostosować go do swoich potrzeb. Zwykle robię 0,5 litra na raz (około 30 płytek).

Stężenia antybiotyków:

Przygotuj wywar w wodzie: dodać 1µl na 1ml podłoża
Kanamycyna (Nr katalog. K4000) - Stock 50mg/ml, końcowe stężenie 50µg/ml
Ampicylina (Nr kat. A9518) - Stężenie podstawowe 100mg/ml, stężenie końcowe 100µg/ml
Streptomycyna (Nr katalog. S6501) - Stock 50mg/ml, stężenie końcowe 50µg/ml
Spectinomycin (Catalog No. S9007) - Zapas 100mg/ml, stężenie końcowe 100µg/ml

Przygotować zapas w etanolu: Dodać 5µl na ml podłoża
Chloramfenikol (Nr kat. C0378) - Stock 34mg/ml, stężenie końcowe 170µg/ml
Tetracyklina HCL (Nr katalogowy  87128) - Stężenie podstawowe 10mg/ml, stężenie końcowe 50µg/ml

Transformacja bakterii

Najprostszymi sposobami wprowadzenia DNA do bakterii są szok termiczny i elektroporacja. Zasada działania szoku termicznego jest dokładnie taka, jak w opisie - należy zaszokować bakterie poprzez podgrzanie. Jeśli nie jest to szok, to nie działa, więc utrzymywanie bakterii w chłodzie do tego czasu jest niezbędne. Nie można tego przesadnie podkreślać. Kiedy bakterie przechodzą od zimna do gorąca, tworzy to dziury w błonach komórkowych i pozwala DNA dostać się do komórki. Elektroporacja działa na podobnej zasadzie, z wyjątkiem tego, że elektryczność tworzy dziury. Procesy te naśladują lub przynajmniej opierają się na naturalnym procesie kompetencji bakterii. Zazwyczaj elektroporacja daje więcej kolonii, ale nie zawsze. Dla większości zastosowań klonowania DNA szok termiczny działa dobrze.

Protokół szoku termicznego transformacji bakteryjnej (powszechna metoda)

1. Odmroź jedną probówkę z gotowymi kompetentnymi komórkami na reakcję DNA/ligacji lub reakcję kontrolną na lodzie i wepchnij probówkę głęboko w lód. Rozmrażanie trwa około 5-10 minut. Utrzymuj komórki tak zimne, jak to możliwe i unikaj dotykania części probówki zawierającej komórki; niewielka ilość ciepła może znacznie zmniejszyć proces transformacji.
2. Pre-chill 15ml Falcon Tubes (Catalog No. SIAL0791) na lodzie i przenieś 3-4 μl reakcji ligacji (lub reakcji kontrolnej) do każdej probówki.
3. Dodaj 95 μl kompetentnych komórek do każdej reakcji ligacji i inkubuj na lodzie przez 20 minut (minimum). Dłużej jest OK, ale testowaliśmy tylko do 45 minut.
4. Wstrząs cieplny w temperaturze 42°C przez 90 sekund w bloku cieplnym lub łaźni wodnej.
5. Następnie dodaj 1 ml bulionu LB (nr katalog. L3022, L2542, lub L3522) lub podłoże SOC (Nr kat. S1797) bez antybiotyku i inkubować komórki w wytrząsarce inkubacyjnej w temperaturze 37°C, 227RPM przez 1 godzinę.
6. Wlej całą LB zawierającą transformowane kompetentne komórki na płytkę agarową zawierającą odpowiedni antybiotyk.
7. Pozostaw płytkę pionowo do wyschnięcia z lekko zdjętą pokrywką w okapie klasy 1 lub w inkubatorze 37°C na około 5-10 minut. Nie rób tego w okapie używanym do hodowli tkanek ssaków. Twoi koledzy nie będą zadowoleni. Nie pozostawiaj płytki do wyschnięcia na zbyt długo, ponieważ niektóre bakterie mogą umrzeć.
8. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37°C. Kolonie, które się pojawią, pochodzą z pojedynczych transformowanych komórek i są odporne na antybiotyk ze względu na obecność plazmidu. Każda kolonia będzie zawierać miliony identycznych kopii tej samej komórki, stąd termin klon.

Protokół szoku termicznego transformacji bakteryjnej (metoda alternatywna)

1. Odmroź jedną probówkę z przygotowanymi wcześniej kompetentnymi komórkami na reakcję DNA/ligacji lub reakcję kontrolną na lodzie i wepchnij probówkę głęboko w lód. Nie umieszczaj jej po prostu na lodzie lub w nim; utrzymuj probówkę tak zimną, jak to tylko możliwe. Rozmrażanie trwa około 5-10 minut. Unikaj dotykania części probówki zawierającej komórki, niewielka ilość ciepła może znacznie zmniejszyć proces transformacji.
2. Dodaj 2-5 μl każdej reakcji ligacji (lub reakcji kontrolnej) do 100 μl kompetentnych komórek. Podczas pipetowania mieszaniny bardzo szybko wymieszaj końcówkę. Nie pipetuj w górę i w dół. Końcówka jest prawdopodobnie w temperaturze pokojowej, więc usuń ją tak szybko, jak to możliwe.
3. Inkubuj na lodzie przez 15 minut (minimum). Dłużej jest OK, ale testowaliśmy tylko do 45 minut.
4. Wstrząs cieplny w temperaturze 37°C przez 3 minuty w bloku cieplnym lub łaźni wodnej.
5. Następnie dodaj 1 ml pożywki LB (numery katalogowe. L3522, L2542, lub&L3022) bez antybiotyku i inkubować komórki przez kolejne 15 minut w temperaturze 37°C.
6. Wlej całą LB zawierającą transformowane kompetentne komórki na płytkę agarową zawierającą odpowiedni antybiotyk.
7. Pozostaw płytkę pionowo do wyschnięcia z lekko zdjętą pokrywką w okapie klasy 1 lub w inkubatorze 37°C na około 5-10 minut. Nie rób tego w okapie używanym do hodowli tkanek ssaków. Twoi koledzy nie będą zadowoleni. Załóż pokrywkę i odwróć płytkę, gdy będzie bliska wyschnięcia. Nie pozostawiaj płytki do wyschnięcia zbyt długo, ponieważ niektóre bakterie mogą umrzeć, gdy agar wyschnie, a także otrzymasz bardzo cienką płytkę agaru!
8. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 ° C. Kolonie, które się pojawią, pochodzą z pojedynczych transformowanych komórek i są odporne na antybiotyk ze względu na obecność plazmidu. Każda kolonia będzie zawierać miliony identycznych kopii tej samej komórki, stąd termin klon.

Zbieranie kolonii bakteryjnych

Ten krok jest łatwy i nie wymaga oddzielnego protokołu, ale biorąc pod uwagę, że jest to ważna część procesu, zamieściliśmy jego krótki opis.

Po przeprowadzeniu transformacji z odpowiednimi kontrolami powinieneś otrzymać trzy płytki bakteryjne. Jeśli wszystko poszło poprawnie, powinieneś mieć wiele kolonii na płytce z ligacją, mniej kolonii (lub w świecie fantazji brak kolonii) na płytce bez fragmentu, ale z ligazą, a nawet mniej kolonii (lub ponownie brak kolonii) na płytkach bez fragmentu i ligazy. Często tło będzie dość wysokie na płytkach kontrolnych i nie musi to oznaczać, że ligacja nie zadziałała, o ile masz więcej kolonii na płytce ligacyjnej. Liczba kolonii wybranych do dalszego badania jest określana przez stosunek kolonii z płytki kontrolnej (która miała ligazę w reakcji) do liczby kolonii na płytce ligacyjnej.

Na przykład, jeśli masz 10 razy więcej kolonii na płytce ligacyjnej w porównaniu z płytką kontrolną, to teoretycznie (jeśli wykonujesz standardowe klonowanie kierunkowe) 9 na 10 wybranych kolonii będzie miało prawidłowy fragment ligowany (zwykle nie jest to prawdą z powodu takich rzeczy jak multimery lub konkatemery itp. W tym przypadku wybranie 5-10 kolonii powinno być więcej niż wystarczające.

Jeśli masz tylko dwa razy więcej kolonii na płytce ligacyjnej w porównaniu do kontroli, to wybranie 10 lub więcej byłoby rozsądne. Płytkę można umieścić w lodówce i w razie potrzeby pobrać więcej kolonii. Nie szalej podczas zbierania kolonii, zbieranie 50 to strata czasu, chyba że wykonujesz bardzo trudną ligację.

Ważne jest, aby uznać niepowodzenie, jeśli nie ma różnicy między płytkami. W takim przypadku nie przejmuj się zbieraniem kolonii. Powtórz poprzednie kroki i spróbuj zmniejszyć tło poprzez dłuższe trawienie, dłuższą defosforylację, mniejszą ekspozycję na promieniowanie UV lub wypróbuj enzymy innej firmy. Dość często enzym po prostu przestał działać.

Protokół pobierania kolonii

1. Po wyjęciu płytek z inkubatora 37ºC umieść je do góry nogami (tj. tak, jak były w inkubatorze).tj. tak jak były w inkubatorze) na blacie stołu.
2. Używając pipety lub podobnego przyrządu, odmierzyć pipetą 3-5 ml pożywki LB  (nr katalog. L3522, L2542, lub  L3022) zawierające odpowiednie stężenie antybiotyku do sterylnych probówek o pojemności 25 ml lub 50 ml (liczba probówek zależy od tego, ile bakterii chcesz wyhodować) lub podobnych probówek z zakrętką i opatrz je etykietą. Stosunek objętości kultury bakteryjnej do ilości powietrza w probówce jest ważny, aby umożliwić bakteriom wzrost do wystarczającej gęstości, jako przybliżony przewodnik nigdy nie należy mieć mniej niż 1:3 stosunku cieczy do powietrza, ale najlepiej więcej.
3. W jednej ręce weź sterylną końcówkę pipety na końcu pipety, drugą ręką podnieś odwróconą płytkę zawierającą bakterie z ligacji. Odwróć płytkę w dłoni tak, aby bakterie były teraz skierowane do góry i delikatnie dotknij końcówką pipety kolonii bakteryjnej, która jest całkowicie odizolowana od innych kolonii.
4. Teraz umieść tę samą końcówkę z bakteriami w jednej z probówek zawierających pożywkę LB (z kroku 2) i poruszaj końcówką, aby uwolnić część bakterii do płynu. Niektórzy ludzie po prostu wyrzucają końcówkę pipety do pożywki, ale jeśli to zrobisz, będziesz musiał ją odzyskać następnego dnia.
5. Hoduj probówki przez noc w inkubowanej wytrząsarce orbitalnej w temperaturze 37ºC przy 190-225 rpm.

Uwaga: Powyższa procedura powinna być wykonywana przy użyciu sterylnej techniki. Najlepiej w pobliżu palnika Bunsena, jeśli nie jest on dostępny, wystarczy okap klasy 1. W rzeczywistości prawdopodobnie ważniejsze jest, aby nie zanieczyścić krzyżowo każdej próbki ze sobą, ponieważ hodujesz je wszystkie w tym samym antybiotyku, niż martwić się o zewnętrzne bakterie zanieczyszczające twoje próbki (ponieważ nie powinny one mieć kasety oporności, chyba że pochodzą z poprzedniego eksperymentu poza twoją ławką).

Zamrażanie kolonii bakteryjnych

Kolonie bakteryjne wyhodowane jako płynna kultura mogą być przechowywane w temperaturze 4°C przez kilka tygodni bez szkody.Każdy klon, który zawiera insert, powinien być przechowywany w celu zapewnienia długoterminowego dostępu. Najpopularniejszą metodą przechowywania klonów są zamrożone zapasy glicerolu. Aby uzyskać alternatywę w temperaturze pokojowej (szczególnie przydatną w przypadku dużej liczby próbek), należy rozważyć nową technologię stosowaną w produktach CloneStable firmy Biomatrica (nr katalogowy  93121-017).

Protokół sporządzania roztworu podstawowego glicerolu

1. Przygotuj 50% roztwór podstawowy glicerolu przez zmieszanie 5 ml glicerolu  (nr kat. G5516) z 5 ml destylowanej, sterylnej wody.  Dobrze wymieszać.
2. Dla każdej przechowywanej kolonii zmieszaj 500 µl hodowli nocnej z 500 µl 50% roztworu glicerolu.  Dobrze wymieszaj i przelej do 2 ml kriowialki.
3. Przechowuj w temperaturze -80°C.

.