Zastosowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)

Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR, czyli PCR z odwrotną transkryptazą, jest odmianą standardowej techniki PCR, która obejmuje amplifikację specyficznego mRNA uzyskanego z bardzo małych próbek. Eliminuje to potrzebę żmudnego procesu oczyszczania mRNA wymaganego w przypadku konwencjonalnych technik klonowania. W przypadku RT-PCR, oprócz standardowych odczynników PCR stosuje się odwrotną transkryptazę i próbkę RNA. Mieszanina reakcyjna jest podgrzewana do 37˚C, co pozwala na wytworzenie komplementarnej kopii cDNA z próbki RNA przez odwrotną transkryptazę. Ten cDNA następnie annealuje do jednego ze starterów, prowadząc do syntezy pierwszej nici. Następuje standardowa PCR, w której ostatecznie generowany jest dsDNA. RT-PCR jest często łączony z PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), który jest szeroko stosowany do ilościowego określania poziomów transkryptów w komórkach i tkankach.

Hot Start PCR

Hot Start PCR to technologia, która hamuje polimerazę Taq lub włączanie zmodyfikowanych dNTP podczas ustawiania reakcji, aż do wystąpienia etapu aktywacji cieplnej. Dostępne są różne metody zatrzymywania aktywności polimerazy gorącego startu i obejmują modyfikację chemiczną, metody z udziałem przeciwciał i aptamerów. 

Endpoint PCR dla długiej i dokładnej amplifikacji celu

Endpoint PCR jest często używany do wykrywania obecności celów i względnej obfitości po zakończeniu reakcji. Ograniczona długość sekwencji wytwarzanych podczas standardowego PCR, około 5 kb, jest częściowo przezwyciężana przez włączenie dodatkowych czynników, które zapewniają aktywność "korekty". Długi i dokładny (LA) PCR obejmuje zastosowanie drugiej termostabilnej polimerazy z egzonukleazą 3′→5′ do naprawy końcowych błędnych nukleotydów, co skutkuje znacznie zwiększoną wiernością i zdolnością do amplifikacji celów DNA o długości do 40 kb.