Standardowy protokół PCR

Jak wykonać PCR

Standardowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) składa się z czterech kroków:

1. Dodaj wymagane odczynniki lub mastermix i matrycę do probówek PCR.
2. Wymieszaj i odwiruj.
3. Aplikuj zgodnie z termocyklerem i parametrami starterów.
4. Oceń amplifikowane DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie barwienia bromkiem etydyny.

Kroki te przedstawiono poniżej bardziej szczegółowo wraz z materiałami i wskazówkami dotyczącymi wyboru odczynników. Jest to podstawowy protokół PCR wykorzystujący polimerazę Taq DNA.

Kroki PCR i niezbędne komponenty PCR

Rozwiązywanie problemów z reakcją PCR obejmuje wiele czynników. Obejrzyj tę animację, aby dowiedzieć się, w jaki sposób wybór odpowiednich komponentów i warunków cyklu może pomóc w osiągnięciu optymalnych wyników.

Znajdź dodatkowe protokoły dla innych polimeraz lub zaawansowanych technik PCR w sekcji Protokoły naszego Przewodnika po technologiach PCR.

Dowiedz się więcej na temat standardowej reakcji PCR, w tym czym ona jest, na naszej Strona Podstawy PCR.

Odczynniki: Co jest potrzebne do PCR?

Odczynnik używany w PCR	Zalecany produkt
Taq Polimeraza DNA	Wybierz Taq Polimeraza DNA na podstawie preferencji użytkownika. (Patrz oddzielna Taq tabela polimerazy poniżej.)
PCR grade water	PCR Reagent Water
Primery rozcieńczone do stężenia roboczego	Zapasy robocze 10 µM są wystarczające dla większości testów.
Oligosy	Custom oligos
DNA do amplifikacji	Dostarczone przez badacza
Dedykowane pipety
Cykler termiczny	Z różnymi rozmiarami bloków dołkowych lub w formacie wieloformatowym
Sterylne końcówki do pipet z filtrem
Sterylne zakręcane mikrokrążki 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówek	Corning® probówki do mikrowirówek z zakrętką
Próbki lub płytki do PCR	Wybierz pasujące do cyklera:
	Pojedyncze cienkościenne probówki PCR o pojemności 200 µL
	Probówki paskowe 200 µL
	Płytki wielodołkowe i uszczelnienie płytki
Mieszanina dNTP	Mieszanina deoksynukleotydów zawierająca po 10 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP *miksy do odczytu zawierają już dNTP

Czym jest Polimeraza Taq DNA?

Taq Polimeraza DNA jest termostabilnym enzymem pochodzącym z termofilnej bakterii Thermus aquaticus. Jest on  powszechnie stosowany do amplifikacji fragmentów DNA w PCR. Enzym występuje w formie rekombinowanej, wyrażonej w E. coli. Jest on w stanie wytrzymać wielokrotne ogrzewanie do 95 °C (czego wymaga technika PCR) bez znaczącej utraty aktywności. Enzym ma masę cząsteczkową około 94 kDa w SDS-PAGE bez wykrywalnej aktywności endonukleazy lub egzonukleazy. Posiada aktywność 5'→3' polimerazy DNA i 5'→3' egzonukleazy. Każda partia polimerazy DNA Taq jest testowana pod kątem amplifikacji PCR i sekwencjonowania dwuniciowego. Enzym jest dostarczany w ilości 5 jednostek/µL i jest dostarczany ze zoptymalizowanym buforem reakcyjnym 10x.

Standardowa Taq polimerazy DNA

Użyj poniższej tabeli, aby wybrać odpowiednią mieszankę polimerazy Taq DNA do warunków reakcji. Do wyboru są preparaty bezbarwne lub barwione na czerwono, z dodatkiem lub bez chlorku magnezu (MgCl₂) lub wstępnie przygotowany readymix lub mieszanina wzorcowa z buforem i dNTP.

Zawierający MgCl2 &		Oddzielony MgCl2	Readymix
Przezroczysty preparat bez barwnika	Z czerwonym barwnikiem do bezpośredniego nakładania na żele	Przezroczysty preparat bez barwnika	Z czerwonym barwnikiem do bezpośredniego nakładania na żele	Przezroczysta formuła bez barwnika
Taq Polimeraza DNA od Thermus aquaticus (D1806)	REDTaq® DNA Polymerase (D4309)	Polimeraza DNA Taq z Thermus aquaticus, bez MgCl2 (D4545)	REDTaq® ReadyMix™ PCR Reaction Mix (R2523)	ReadyMix™ Taq PCR Reaction Mix (P4600)

Definicja jednostki: Jedna jednostka włącza 10 nmoli całkowitych trifosforanów dezoksyrybonukleozydów do DNA wytrącającego się z kwasu w ciągu 30 minut w temperaturze 74 °C.

Procedura: Etapy PCR

Optymalne warunki dla stężenia polimerazy DNA Taq, matrycy DNA, starterów i MgCl₂ będą zależeć od używanego systemu. Konieczne może być określenie optymalnych warunków dla każdego pojedynczego składnika. Dotyczy to w szczególności polimerazy DNA Taq, parametrów cyklu i stężenia MgCl₂. Zaleca się miareczkowanie enzymu i MgCl₂ w celu określenia optymalnej wydajności.

1. Dodaj odczynniki do odpowiedniej wielkości probówki w kolejności podanej w tabeli. (Wybierz odpowiednią tabelę dla konfiguracji reakcji: odczynnik standardowy lub readymix.) W przypadku dużej liczby reakcji należy przygotować mastermix bez szablonu i podzielić go na probówki reakcyjne. Na końcu należy dodać matrycę do odpowiednich probówek.
   

Standardowa reakcja PCR

Amount	Component	Stężenie końcowe
w µL	Woda
5 µL	10x PCR Buffer (P2192 lub P2317)*	1x
1 µL	Mieszanka deoksynukleotydów	200 µM
w µL	Starter do przodu (zazwyczaj o długości 15-30 zasad)	0.1-0.5 µM
x µL	(zazwyczaj o długości 15-30 zasad)	0.1-0,5 µM
0.5 µL	Taq Polimeraza DNA*	0.05 jednostek/µL
y µL	Wzorcowe DNA (zazwyczaj 10 ng)	200 pg/µL
z µL	25 mM MgCl2 (używać tylko z buforem P2317)	0.1-0.5 mM
50 µL	Całkowita objętość reakcji

*Kup razem bufor i polimerazę Taq : D1806, D4309 lub D4545

Readymix PCR Reaction

Ilość	Składnik	Stężenie końcowe
25 µL	Readymix (R2523 lub P4600)
w µL	Starter do przodu (zazwyczaj o długości 15-30 zasad)	0.1-0.5 µM
x µL	Starter odwrotny (zazwyczaj o długości 15-30 zasad)	0.1-0.5 µM
y µL	Template DNA (typowo 10 ng)	200 pg/µL
z µL	Woda
50 µL	Całkowita objętość reakcji

2. Delikatnie wymieszaj przez worteksowanie i krótko odwiruj, aby zebrać wszystkie składniki na dnie probówki.

Uwaga: Dodaj 50 µL oleju mineralnego na wierzch każdej probówki, aby zapobiec parowaniu, jeśli używasz termocyklera bez podgrzewanej pokrywy.

3. Amplikuj. Parametry amplifikacji będą się różnić w zależności od użytych starterów i termocyklera. Może być konieczne zoptymalizowanie systemu dla poszczególnych starterów, matrycy i termocyklera.

Typowe parametry amplifikacji

Zaleca się 25-30 cykli amplifikacji.

Krok PCR	Temperatura °C	Czas trwania
Szablon temperatury	94 °C	1 min
Ugrzewanie starterów	55 °C	2 min
Przedłużenie	72 °C	3 min

4. Zamplifikowane DNA można ocenić za pomocą elektroforeza w żelu agarozowym i późniejsze barwienie bromkiem etydyny.

      Uwaga: Nakładka oleju mineralnego może być usunięta przez pojedynczą ekstrakcję chloroformem (1:1), odzyskując fazę wodną.

Odczynniki do elektroforezy kwasów nukleinowych

• Agaroza  (żele prefabrykowane, proszek, itp.)
• Bufor taki jak MOPS-EDTA-octan sodu, tris-octan-EDTA (TAE) lub tris-boran-EDTA (TBE)
• Roztwór do ładowania żelu i bufor do ładowania próbki dla RNA
• Barwnik do elektroforezy lub barwnik taki jak bromek etydyny

1. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

2. Chou Q. 1992. Minimizing deletion mutagenesis artifact duringTaqDNA polymerase PCR byE.coliSSB. Nucl Acids Res. 20(16):4371-4371. https://doi.org/10.1093/nar/20.16.4371

3. Innis MA. 1995. PCR Strategies. New York: Academic Press.

4. Innis MA. 1990. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. New York: Academic Press.

5. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. 1988. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85(24):9436-9440. https://doi.org/10.1073/pnas.85.24.9436

6. Newton CR. 1995. PCR: Essential Data. 1. Wiley-Blackwell.

7. Olive DM, Simsek M, Al-Mufti S. 1989. Polymerase chain reaction assay for detection of human cytomegalovirus.. 27(6):1238-1242. https://doi.org/10.1128/jcm.27.6.1238-1242.1989

8. Pääbo S, Gifford JA, Wilson AC. 1988. Mitochondrial DNA sequences from a 7000-year old brain. Nucl Acids Res. 16(20):9775-9787. https://doi.org/10.1093/nar/16.20.9775

9. Erlich HA. 1989. PCR technology : principles and applications for DNA amplification. New York: Stockton Press.

10. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

11. Sarkar G, Kapelner S, Sommer SS. 1990. Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucl Acids Res. 18(24):7465-7465. https://doi.org/10.1093/nar/18.24.7465

12. Winship PR. 1989. An lmproved method for directly sequencing PCR-amplified material using dimethyl sulphoxide. Nucl Acids Res. 17(3):1266-1266. https://doi.org/10.1093/nar/17.3.1266

Oświadczenie licencyjne

UWAGA DLA NABYWCY: OŚWIADCZENIE O UDZIELENIU LICENCJI

Wraz z zakupem niniejszego produktu nie jest przekazywana żadna licencja w ramach któregokolwiek z patentów USA nr. 5,804,375, 5,994,056, 6,171,785, 6,214,979, 5,538,848, 5,723,591, 5,876,930, 6,030,787 i 6,258,569 oraz odpowiadających im patentów poza Stanami Zjednoczonymi, ani żadnych innych patentów lub wniosków patentowych dotyczących procesów 5' nukleazy i barwnika wiążącego dsDNA. W celu uzyskania dalszych informacji należy skontaktować się z Dyrektorem ds. Licencjonowania, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA