Protokół SeqPlex Enhanced DNA Amplification Kit (SEQXE)

Opis produktu
Przebieg pracy
Dostarczone odczynniki
Przechowywanie/Stabilność
Procedura
Załącznik 1: Opcjonalny test usuwania starterów
Przewodnik rozwiązywania problemów
FAQ
Materiały

Opis produktu

Zestaw SeqPlex DNA Amplification Kit (SEQXE) do amplifikacji całego genomu (WGA) został zaprojektowany w celu ułatwienia sekwencjonowania następnej generacji (NGS) z bardzo małych ilości lub ze zdegradowanego/wysoko pofragmentowanego DNA. Wydajność z immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) lub utrwalonych w formalinie próbek tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) jest często mniejsza niż wymagana do pomyślnego przygotowania biblioteki NGS. Zestaw SeqPlex umożliwia użytkownikowi wstępną amplifikację tych i innych próbek DNA o małej ilości/wysoce pofragmentowanego DNA w celu wprowadzenia ich do przepływu pracy NGS. 

Proces SeqPlex składa się z trzech etapów: wstępnej amplifikacji, amplifikacji i usuwania starterów. Zobacz poniższy schemat przepływu pracy w procesie SeqPlex.  

W pierwszym etapie, wstępnej amplifikacji, DNA jest replikowane przy użyciu starterów składających się z częściowo zdegenerowanego 3'-końca i uniwersalnego 5'-końca. W miarę postępu polimeryzacji, przemieszczone pojedyncze nici służą jako nowe szablony dla dodatkowego wyżarzania i wydłużania starterów. Produkt wstępnej amplifikacji składa się z losowych, nakładających się amplikonów, które są otoczone uniwersalną sekwencją końcową.

W drugim etapie, amplifikacji, produkt wstępnej amplifikacji jest amplifikowany przez PCR z pojedynczym starterem poprzez uniwersalną sekwencję końcową. Produkt amplifikacji SeqPlex waha się od 200 do 500 par zasad. Amplikony z ChIP i/lub zdegradowanego DNA, takiego jak FFPE, są zazwyczaj krótsze i zależą od długości wyjściowego DNA.

Trzeci etap, usuwanie primerów, usuwa primery i częściowo zdegenerowane sekwencje z puli amplikonów, dzięki czemu DNA SeqPlex jest gotowe do wprowadzenia do przepływu pracy NGS.

Dostarczone odczynniki

Odczynnik	Nr kat.	10 RXN	50 RXN	500 RXN
Bufor przygotowujący bibliotekę	LP100	20 µL	100 µL	1000 µL
Enzym do przygotowania biblioteki	E0531	10 µL	50 µL	500 µL
5x Amplification Mix	A5112	235 µL	1.15 mL	11.5 mL
Polimeraza DNA dla SeqPlex	SP300	20 µL	100 µL	1 mL
10x Primer Removal Buffer	SR401	165 µL	825 µL	8.2 ml
Enzym usuwający prymery	SR402	42 µL	210 µL	2 ml
Roztwór do usuwania primerów	SR400	33 µL	165 µL	1.6 mL
Woda, odczynnik do biologii molekularnej	W4502	5 mL	25 mL	220 mL

Przechowywanie/Stabilność

Wszystkie składniki powinny być przechowywane w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu w celu użycia, składniki powinny być przechowywane w lodzie. Rozpuścić wszelkie osady w tych roztworach przez krótkie podgrzanie w temperaturze 37 °C, dokładnie mieszając. Stabilność enzymu do przygotowywania bibliotek i enzymu do usuwania primerów zostanie zakłócona w przypadku przechowywania w temperaturze powyżej -20 °C lub pozostawienia na dłuższy czas w temperaturze powyżej 4 °C

Procedura

Poniższa procedura została z powodzeniem zastosowana do amplifikacji i sekwencjonowania 100 pg wyizolowanego DNA ChIP i 100 pg pofragmentowanego genomowego DNA. Uszkodzone DNA, takie jak wyizolowane z tkanek FFPE, może wymagać od 5 do 10 razy więcej wejściowego DNA, w zależności od stopnia uszkodzenia. Reakcje mogą być skalowane w górę lub w dół, aby dostosować się do przygotowania potrzebnych ilości amplifikowanego DNA.

Uwaga: Ostateczna wydajność po amplifikacji i usunięciu starterów różni się znacznie w zależności od jakości wyjściowego DNA. W większości przypadków można oczekiwać od 1 do 2 μg. W przypadku większych ilości należy przeprowadzić wiele reakcji.

Uwaga: Niniejsza procedura została opracowana przy użyciu określonych odczynników dostarczonych lub zalecanych do stosowania z tym zestawem.

Preamplifikacja

1. Dla najlepszego pokrycia amplifikacji SeqPlex i wyników NGS, optymalny początkowy rozmiar DNA wynosi 200-500bp. DNA z wielu próbek ChIP i FFPE mieści się już w tym zakresie wielkości. Takie próbki nie wymagają dodatkowej fragmentacji przed krokiem 4 protokołu SeqPlex.
   Jeśli wyjściowe DNA nie mieści się w zakresie wielkości 200-500 bp, zdecydowanie zaleca się fragmentację. DNA można fragmentować za pomocą sonikacji, urządzenia Covaris lub fragmentacji enzymatycznej.
   
   
2. Jeśli to możliwe, określ stężenie DNA za pomocą absorpcji UV (260 nm) i użyj do 1 ng na reakcję.W4502). Dokładnie wymieszać.
   
   
3. Połączyć w następujący sposób:
       2 µL z Library Preparation Buffer (LP100)
     .nbsp;  X µL DNA (do 1 ng)
       Y µL wody (.W4502)
       --------------------------------------------------
       14 µL Całkowita objętość reakcji
   
   Ostrożnie dla doświadczonych użytkowników GenomePlex^® WGA: Kilka składników zestawu SeqPlex Enhanced DNA Amplification Kit (SEQXE), zestawu SeqPlex DNA Amplification Kit (SEQX), zestawów GenomePlex WGA, zestawu Transplex^® WTA1 i zestawu Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2) ma podobną nazwę. Chociaż ogólnie analogiczne w funkcji, nie są one wymienne.
   
   
4. Dokładnie wymieszać, krótko odwirować i inkubować w termocyklerze zaprogramowanym na:
       95 °C przez 2 minuty
       4 °C Hold
   
   
5. Po schłodzeniu próbki do temperatury 4 °C, dodać 1 µL enzymu przygotowującego bibliotekę (E0531).Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać. Odwirować krótko i natychmiast przejść do następnego kroku.
   
   
6. Umieść reakcję w termocyklerze i inkubuj w następujący sposób:
       16 °C przez 20 minut
       24 °C przez 20 minut
       37 °C przez 20 minut
   .     75 °C przez 5 minut
      4 °C Hold
   
7. Wyjmij próbkę z termocyklera i krótko odwiruj. Amplifikację można zakończyć natychmiast lub przechowywać produkt amplifikacji wstępnej w temperaturze -20 °C przez maksymalnie trzy dni.
   
   Uwaga - doświadczeni użytkownicy GenomePlex WGA:
   - SeqPlex używa 5-krotnej mieszaniny amplifikacyjnej
   - SYBR Green (S9430) jest zalecany do monitorowania amplifikacji
   - Temperatura wyżarzania/rozszerzania wynosi 70 ^oC
   - Wymagane jest 30-minutowe podtrzymanie 70 ^oC po amplifikacji<
8. Dodaj następujące odczynniki do 15 ml produktu wstępnej amplifikacji z kroku 8. (W przypadku wielu reakcji można przygotować mieszaninę wzorcową. Dodaj 60 ml mieszaniny wzorcowej do każdej reakcji):
       15 µL 5X Amplification Mix (A5112)
       1.5 µL Polimeraza DNA dla SeqPlex (SP300)
       42.5 µL Wody (W4502)
       1 µL SYBR Green I (S9430) rozcieńczony 1/1000*
       - µL barwnika referencyjnego specyficznego dla przyrządu (opcjonalnie)
       --------------------------------------------------
       75 µL Całkowita objętość reakcji
   
   

*W celu uzyskania najlepszej reprezentacji, zdecydowanie zaleca się PCR w czasie rzeczywistym z dodatkiem SYBRGreen I do reakcji amplifikacji, aby umożliwić monitorowanie postępu reakcji.SYBRGreen I (S9430) należy rozcieńczyć 1000-krotnie (1/1000) i użyć 1 µl na 75 µl reakcji amplifikacji SeqPlex, aby uniknąć zahamowania reakcji amplifikacji.

Optymalne wyniki uzyskuje się, wykonując co najmniej 2-3 cykle po rozpoczęciu "plateau" amplifikacji, jak wskazano na rysunku 1. Optymalna liczba cykli amplifikacji różni się w zależności od początkowej ilości i jakości matrycy DNA.

Jeśli amplifikacja jest wykonywana bez dodawania SYBRGreen I, 18 do 24 cykli zwykle daje dobre wyniki przy 0,1-1,0 ng wysokiej jakości DNA. Niska jakość DNA może wymagać większych ilości wejściowych i/lub większej liczby cykli. Jeśli ilości wejściowe są bliskie
10 pg, do osiągnięcia plateau amplifikacji może być wymagane aż 29 cykli.

Uwaga: Jeśli do osiągnięcia plateau wymagane jest więcej niż 29 cykli, kolejne wyniki NGS mogą być niezadowalające. Zapoznaj się z Przewodnikiem rozwiązywania problemów.

10. Dokładnie wymieszać i przeprowadzić cykl w termocyklerze czasu rzeczywistego w następujący sposób:

Denaturacja początkowa: 94 °C przez 2 minuty
Cykl do 2-3 cykli do plateau:
    94 °C Denaturacja przez 15 sekund
    70 °C Anneal/Extend przez 5 minut
    (odczyt fluorescencji)
Po cyklu:
    70 °C przez 30 minut
    4 °C Hold

Uwaga: Wydłużona inkubacja w temperaturze 70°C po cyklu jest absolutnie niezbędna do skutecznego usunięcia primera.

Reakcje można oczyścić natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu oczyszczenia.

11. Oczyścić przy użyciu zestawu GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020). Elucję przeprowadzić w 50 µL wody wolnej od nukleaz.

12. Określić stężenie oczyszczonego DNA mierząc absorbancję przy 260 nm. Jedna jednostka A₂₆₀ odpowiada 50ng/µL DNA. Wydajność w tym punkcie będzie się różnić w zależności od jakości wyjściowego DNA, ale zwykle wynosi 1-5 µg.

Uwaga: Alternatywne techniki pomiarowe, takie jak PicoGreen^®, często zaniżają rzeczywistą wydajność SeqPlex DNA.

Na tym etapie SeqPlex DNA nadaje się do qPCR i mikromacierzy. Usuwanie starterów SeqPlex jest zalecane do głębokiego sekwencjonowania.

Opcjonalnie: Jakość amplifikacji można ocenić za pomocą elektroforezy żelowej lub kapilarnej. Zazwyczaj 1 ml surowego lub oczyszczonego produktu amplifikacji jest wystarczający dla chipów kapilarnych, takich jak te dla Bioanalyzera firmy Agilent, podczas gdy 5 ml jest zwykle wystarczające do elektroforezy w żelu agarozowym.

Usuwanie primeru

Uwaga - doświadczeni użytkownicy GenomePlex WGA: Zaleca się reakcję wejściową 2,1 μg, aby uzyskać wystarczającą ilość produktu do wprowadzenia do większości przepływów pracy głębokiego sekwencjonowania (> 1μg).

13. Połączyć następujące składniki na lodzie:
    8.0 µL - 10x Primer Removal Buffer (SR401)
    1.6 µL - Roztwór do usuwania primerów (SR400)
    X µL - 2.1 μg oczyszczonego SeqPlex DNA
    Y µL - wody (W4502)
    --------------------------------------------------
    76.25 µL Całkowita objętość reakcji

14. Wymieszać, a jeśli wykonywany jest opcjonalny test usuwania primerów (patrz Dodatek 1 poniżej), usunąć 5 ml do oddzielnej probówki do kontroli "bez enzymu usuwającego primery".

15. Dodaj 3,75 µL - enzymu do usuwania primerów (SR402) do pozostałych 71,25 µL z kroku 13.

16. Inkubować obie reakcje ± enzymatyczne w następujący sposób:
    37 °C przez 60 minut
    65 °C przez 20 minut
    4 °C Hold

17. Wyjąć reakcje z termocyklera, krótko odwirować i wymieszać. Reakcje można przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie trzy dni lub natychmiast oczyścić.

18. W przypadku wykonywania opcjonalnego testu usuwania starterów, usuń i zachowaj 5 µL z reakcji "z enzymem usuwającym startery" (patrz Dodatek 1 poniżej) przed oczyszczeniem.

19. Oczyść pozostałą reakcję z enzymem usuwającym startery przy użyciu zestawu GenElute PCR Clean-up Kit, jak opisano wcześniej w kroku 10.

19.

Sekwencjonowanie

DNA SeqPlex jest teraz gotowe do wprowadzenia do przepływów pracy sekwencjonowania nowej generacji, w tym przygotowania końców, ale generalnie nie wymaga fragmentacji ani wyboru rozmiaru. Większość SeqPlex DNA waha się od 200 do 500 par zasad. Chociaż zazwyczaj nie jest to konieczne, dodatkową fragmentację można przeprowadzić mechanicznie lub enzymatycznie.

Każdy koniec amplikonu SeqPlex będzie miał 5'-fosforan i 2-bazowy 3'-nadmiar po usunięciu primera. Przed ligacją starterów do sekwencjonowania, polski dwuniciowy fragment kończy się polimerazą T4.

Każdy amplikon SeqPlex zachowujący starter po usunięciu startera będzie miał 5'-hydroksyl. Obróbka kinazą DNA T4 nie jest wymagana, a jej pominięcie ograniczy ligację starterów sekwencjonowania do wszelkich pozostałości niestrawionego produktu SeqPlex.

3'-adenylacja w przepływie pracy Illumina w dużej mierze zapobiega występowaniu produktów ligacji, takich jak chimery. Chimery zostały zgłoszone podczas przygotowywania i sekwencjonowania biblioteki Roche 454. W przypadku sekwencjonowania ABI SoLID, drugi etap określania rozmiaru przed sekwencjonowaniem może pomóc w zmniejszeniu chimery lub konkatemerów.

Profil produktu

Zademonstrowano, że ten zestaw służy do amplifikacji próbek ChIP DNA i całych genomowych pofragmentowanych szablonów DNA. Należy pamiętać, że określona sekwencja w wysoce złożonej próbce DNA, takiej jak wejściowe DNA ChIP, może nie ulegać amplifikacji w takim samym stopniu, jak ta sama sekwencja w mniej złożonej próbce DNA, takiej jak ChIPed DNA. Dlatego poziomy reprezentacji najlepiej porównywać między próbkami o podobnej złożoności, takimi jak ChIPed DNA z leczonych i nieleczonych komórek lub guza i normalnej tkanki.
SeqPlex DNA został z powodzeniem przygotowany do sekwencjonowania na GAIIx i MiSeq firmy Illumina przy użyciu standardowych protokołów przepływu pracy Illumina, w tym: przygotowania końców, polerowania, amplifikacji i wyboru rozmiaru.
Zdecydowanie zalecamy potwierdzenie jakości SeqPlex DNA po usunięciu starterów poprzez wykonanie PCR ze starterami do krótkich (<300bp) sekwencji DNA, o których wiadomo, że są obecne w wyjściowym DNA przed przesłaniem próbek do sekwencjonowania następnej generacji.

Uwaga: Nie oczekuje się, że produkty PCR lub startery zawierające sekwencję 5'-CTGAAG-3' lub 5'-CTTCAG-3' ulegną amplifikacji po usunięciu startera.

Przykład produktu PCR, który NIE ulegnie amplifikacji po usunięciu startera:

Obecność określonych celów w DNA SeqPlex można również potwierdzić za pomocą PCR lub mikromacierzy przed lub po usunięciu starterów.

Stabilność SeqPlex DNA jest równoważna genomowemu DNA przechowywanemu w identycznych warunkach.

Apendix 1

Opcjonalnie: Test usuwania starterów
Skuteczność usuwania starterów można ocenić, wykonując qPCR przy użyciu 5X Amplification Mix (A5112), polimerazy DNA dla SeqPlex (SP300) i 5 µl zachowanych próbek z kroków 18 i 14 powyżej dla "z" i "bez enzymu usuwającego startery". Dla każdej reakcji amplifikacji dostarczana jest wystarczająca ilość 5-krotnej mieszaniny amplifikacyjnej i polimerazy DNA do przeprowadzenia jednego testu usuwania starterów, "z" i "bez enzymu usuwającego startery".

1. Seryjnie rozcieńczyć próbki enzymu "z" i "bez usuwania primerów" 1 000 000 razy (np. 1 µL na 99 µL wody, 3 razy kolejno).
   
   
2. Przygotuj mieszaninę testową dla obu próbek, łącząc:
       6.6 µL 5X Amplification Mix (A5112)
       0,33 µL DNA Polymerase for SeqPlex (SP300)
       0,33 µL rozcieńczenia 1/1,000, SYBR Green (S9430) w wodzie
       3.75 µL wody (W4502)
   
   Uwaga: Odczynniki wymagające małych objętości na test można rozcieńczyć wodą przed dodaniem, aby uniknąć niedokładności pomiaru lub można przygotować wzorcową mieszaninę testową do wielu testów.
   
   
3. Pipet 10 µL zarówno 1,000,000 razy rozcieńczonego SeqPlex "z" i "bez" enzymu do oddzielnych probówek PCR lub studzienek.
   
4. Połączyć 5 µL mieszaniny testowej z kroku 2 z każdymi 10 µL rozcieńczonych 1 000 000 razy produktów SeqPlex z kroku 3.
   
5. Aplikuj w następujący sposób:
       94° C przez 2 minuty.
       30 - 35 cykli*
           94° C przez 15 sekund
           70° C przez 5 minut (odczyt)

Ct/Cq dla reakcji "z" enzymem do usuwania starterów, która jest co najmniej 4 cykle większa niż dla reakcji "bez" enzymu, wskazuje na pomyślne usunięcie starterów.

Odniesienie

1. Lo R, Matthews J. 2012. High-Resolution Genome-wide Mapping of AHR and ARNT Binding Sites by ChIP-Seq. 130(2):349-361. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfs253

Przewodnik rozwiązywania problemów

Obserwacja	Przyczyna	Zalecane rozwiązanie
Po amplifikacji nie wykryto żadnego produktu.	Nieprawidłowa temperatura lub czas wygrzewania/rozszerzania	Przeprowadź reakcję ponownie z wygrzewaniem/rozszerzaniem w temperaturze 70 °C przez 5 minut w każdym cyklu.
	Zbyt mała liczba cykli PCR podczas amplifikacji	.Przeprowadź reakcję ponownie z większą liczbą cykli (do 29) i monitoruj amplifikację za pomocą SYBR Green w termocyklerze czasu rzeczywistego
	Startowe DNA było niewystarczające lub zbyt mocno zdegradowane	Przeprowadź reakcję ponownie z większą ilością wyjściowego DNA
Nie zaobserwowano krzywej amplifikacji podczas monitorowania PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)	SYBR Green nie został dodany	SYBR Green I, nr kat. S9430, nie jest dołączony do odczynników SeqPlex, ale musi być dodany do monitorowania PCR w czasie rzeczywistym.
	Może być wymagany barwnik referencyjny specyficzny dla urządzenia qPCR	Dodaj barwnik referencyjny specyficzny dla urządzenia. Jeśli dodanie barwnika referencyjnego nie jest możliwe, należy wykonać nadmiar cykli, aby zapewnić pełny cykl. Dodatkową pomoc można znaleźć w FAQ.
Nadmierna (>60%) lub całkowita utrata SeqPlex DNA wykryta po usunięciu starterów	Słaby odzysk podczas czyszczenia	Powtórzyć trawienie i przeprowadzić czyszczenie za pomocą zestawu GenElute PCR Clean-up Kit, upewniając się, że użyto pełnych 5 objętości roztworu wiążącego, aby rozcieńczyć roztwór płuczący odpowiednią objętością etanolu i odpowiednio osuszyć kolumnę przed elucją.
	Enzym do usuwania prymerów jest zanieczyszczony nukleazą	Użyć nowej porcji Primer Removal Enzyme (SR402) lub jeśli nowa porcja nie jest dostępna, zakupić nowy zestaw SeqPlex Enhanced DNA Amplification Kit (SEQXE)
	Stężenie produktu SeqPlex zbyt niskie dla metody wykrywania	Użyj specyficznych starterów qPCR z krzywą standardową wykonaną z SeqPlex DNA przed usunięciem starterów, aby oszacować stężenie SeqPlex po usunięciu starterów.Uwaga: Startery zawierające 5'-CTGAAG-3' lub 5'-CTTCAG-3' w matrycy nie są kompatybilne z PCR po usunięciu starterów.
Kontrola PCR przed usunięciem primera zadziałała, ale kontrola PCR po nie powiodła się	.Startery do sprawdzenia PCR amplifikują sekwencję, która została rozszczepiona podczas usuwania starterów	Wybierz nowe startery PCR, które nie flankują regionu zawierającego 5'-CTGAAG-3' lub 5'-CTTCAG-3' do amplifikacji.
	DNA SeqPlex zostało całkowicie zdegradowane podczas usuwania primerów	Patrz powyżej dla "Nadmierna (>60%) lub całkowita utrata SeqPlex DNA wykryta po usunięciu primera"
Zła reprezentacja po NGS	DNA wejściowe SeqPlex nie zostało oczyszczone do 200-500bp	Weryfikuj rozmiar i fragment, jeśli to konieczne, przed rozpoczęciem procedury SeqPlex.
	Niewystarczająca liczba cykli podczas amplifikacji SeqPlex	Monitoruj cykl amplifikacji i wykonaj co najmniej 2-3 cykle po plateau. Jeśli monitorowanie całkowicie zawiedzie, można użyć domyślnej wartości 29 cykli.
Nieprawidłowości NGS IVC	Wykresy IVC pokazują identyczną sekwencję (starter) dla pierwszych kilku nukleotydów w wielu odczytach	Optymalne wywoływanie klastrów przyrządów można osiągnąć poprzez normalizację przebiegu do pasa, który nie zawiera DNA SeqPlex.

Często zadawane pytania

1. Czy SeqPlex DNA jest kompatybilny z mikromacierzami i qPCR? Tak, SeqPlex DNA, z lub bez usuwania starterów, może być używany w tych zastosowaniach, podobnie jak genomowe DNA lub istniejące produkty GenomePlex.
   
   
2. Czy istnieją zalety SeqPlex w porównaniu z GenomePlex, jeśli usuwanie starterów nie jest konieczne?
   
3. Czy zmniejszenie liczby cykli podczas amplifikacji poprawi reprezentację?  Nie, cykl co najmniej 2-3 cykli poza "plateau" osiąga optymalną reprezentację. Niewystarczająca liczba cykli prowadzi do znacznego zmniejszenia reprezentacji/pokrycia.
   
   
4. Jeśli monitorowanie cyklu amplifikacji za pomocą PCR w czasie rzeczywistym nie jest możliwe, ile cykli należy wykonać? Gdy optymalne warunki cyklu nie mogą być określone przez monitorowanie, sugeruje się nadmierną liczbę cykli. Dla 100 pg-1 ng próbek ChIP; 24 cykle powinny być wystarczające. W przypadku danych wejściowych mniejszych niż 100 pg lub niskiej jakości; 29 cykli powinno być wystarczające.
   
   
5. Czy starter SeqPlex pozostały po usunięciu startera zakłóci wywoływanie klastrów sekwenatora nowej generacji?  Nie, SeqPlex DNA z minimalną ilością pozostałego startera wygeneruje doskonałą sekwencję na Illumina GAIIx i MiSeq. Aby uzyskać optymalne wywoływanie klastrów SeqPlex DNA, patrz Przewodnik rozwiązywania problemów dla "Nieprawidłowości NGS IVC."
   
   
6. Czy enzym SeqPlex Primer Removal Enzyme usunie cały starter SeqPlex? Tak, enzym SeqPlex Primer Removal Enzyme usuwa kompletny starter, ale trawienie może nie być w 100% kompletne.
   
   
7. Czy wszystkie kopie startera SeqPlex zostaną całkowicie usunięte?  Może pozostać niewielka ilość kompletnego startera SeqPlex. Większość DNA SeqPlex (>90%) będzie miała starter SeqPlex całkowicie usunięty.
   
   
8. Jakiej wydajności należy się spodziewać?  Wydajność jest bardzo zmienna i zależy od wielu czynników. Zaczynając od 100 pg ChIP DNA, oczekuje się około 1-5 ug produktu amplifikacji i 1-3 µg SeqPlex DNA gotowego do przygotowania biblioteki NGS z każdej reakcji usuwania starterów.
   Uwaga: Należy spodziewać się do 50% redukcji produktu przy usuwaniu starterów.Dlatego też, jeśli do sekwencjonowania potrzebne jest 1 μg, należy przeprowadzić wiele oddzielnych reakcji usuwania primerów o masie 2 μg.
   
9. Czy zestaw do reamplifikacji GenomePlex (WGA3) może być używany z SeqPlex?  Nie, DNA SeqPlex przed i po usunięciu primera jest niekompatybilne z zestawem do reamplifikacji GenomePlex. Sekwencje starterów różnią się.
   
   
10. Czy SeqPlex DNA wymaga specjalnych protokołów sekwencjonowania NGS?  Nie, SeqPlex DNA pasuje bezpośrednio do przepływów pracy NGS, podobnie jak ChIP DNA. Operatorzy urządzeń do sekwencjonowania powinni zostać powiadomieni o uruchomieniu SeqPlex DNA i oczekiwać niewielkiego sygnału z wszelkich pozostałych starterów na wykresach IVC.

.