Protokół ekstrakcji policzkowego DNA i amplifikacji WGA

Ten protokół zapewnia prostą i wygodną metodę izolacji, amplifikacji i oczyszczania genomowego DNA z wymazów z policzka. Wymazy z policzka są wygodną metodą pozyskiwania próbki DNA. Po wyizolowaniu DNA za pomocą protokołu ekstrakcji miniprep, można go amplifikować za pomocą protokołu amplifikacji całego genomu.

Protokół miniprep genomowego DNA

W celu uzyskania najlepszych wyników, do tego procesu należy użyć zestawu GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (G1N10).

1. Osusz zebrane wymazy w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
2. Dodaj 280 μL Roztworu do Lizy T i 20 μL Proteinazy K. Włóż wymazówkę i delikatnie odwiruj. Zamknąć probówkę i wymieszać przez worteksowanie.
3. Ikubować próbkę w temperaturze 55°C przez 20 minut z okazjonalnym worteksowaniem.
4. Dodać 200 μL Roztworu do Lizy C i dokładnie worteksować przez 15 sekund.
5. Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
6. Dodać 500 μL Roztworu Przygotowującego Kolumnę do każdej Kolumny Wiążącej GenElute Miniprep (czerwony o-ring) i odwirować przy 12 000 × g przez 1 minutę. Wyrzucić płyn przepływowy.
   Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością
7. Dodaj 200 μL 95-100% etanolu do lizatu z kroku 5.
8. Dokładnie wymieszaj przez worteksowanie i dodaj całą zawartość probówki do kolumny wiążącej.
9. Wiruj z prędkością ≥6500 × g przez 1 minutę.
10. Odrzuć probówkę zbierającą zawierającą przepływ i umieść kolumnę wiążącą w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 ml.
11. Dodaj 500 μL roztworu płuczącego (pamiętaj o rozcieńczeniu etanolem przed pierwszym użyciem) i wiruj z prędkością ≥6500 × g przez 1 minutę.
12. Odrzuć probówkę zbierającą i przepływową i umieść kolumnę wiążącą w nowej probówce zbierającej o pojemności 2 ml.
13. Dodaj kolejne 500 μL roztworu płuczącego do kolumny wiążącej i wiruj z maksymalną prędkością (12 000-16 000 × g) przez 3 minuty, aby wysuszyć kolumnę wiążącą.
14. Nanieść pipetą 200 μL roztworu do elucji na kolumnę wiążącą i wirować przez 1 minutę z prędkością ≥6500 × g.
15. Przechowywać wymyte DNA w temperaturze -20 °C lub przejść do etapu amplifikacji.
    Uwaga: W przypadku korzystania z WGA2 nie ma potrzeby dostarczania polimerazy DNA, ponieważ enzym jest dostarczany wraz z zestawem
    

Protokół amplifikacji całego genomu (WGA)

.Protokół amplifikacji całego genomu GenomePlex przeprowadzonej przy użyciu zestawu GenomePlex Whole Genome Amplification Kit (WGA1) i/lub zestawu Complete Whole Genome Amplification Kit (WGA2).

Fragmentacja

1. Przygotuj roztwór DNA o stężeniu 1 ng/ml z protokołu ekstrakcji krwi pełnej opisanego powyżej.
2. Dodaj 1 µL 10X buforu do fragmentacji do 10 µL DNA (1 ng/µL) w probówce PCR.
3. Umieść probówkę w termocyklerze w temperaturze 95 °C na dokładnie 4 minuty. Uwaga, inkubacja jest wrażliwa na czas i wszelkie odchylenia mogą zmienić wyniki.
4. Natychmiast schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.

Przygotowanie biblioteki

1. Dodaj 2 µL 1x buforu do przygotowania biblioteki.
2. Dodaj 1 µL roztworu stabilizującego bibliotekę.
3. Dokładnie wymieszaj i umieść w termocyklerze w temperaturze 95 °C na 2 minuty.
4. Schłodź próbkę na lodzie i krótko odwiruj.
5. Dodaj 1 µL enzymu przygotowującego bibliotekę, dokładnie wymieszaj i krótko odwiruj.
6. Umieść próbkę w termocyklerze i inkubuj w następujący sposób:
       16 °C przez 20 minut
       24 °C przez 20 minut
       37 °C przez 20 minut.br>     75 °C przez 5 minut
       4 °C hold
7. Wyjmij próbki z termocyklera i krótko odwiruj. Próbki mogą być amplifikowane natychmiast lub przechowywane w temperaturze - 20 °C do trzech dni.
   

Amplifikacja

1. Dodaj następujące odczynniki do całej 15 µL reakcji:
       7.5 µL 10x Amplification Master Mix
       47,5 µL Nuclease Free Water
       5,0 µL JumpStart Taq DNA Polymerase (12.5 jednostek) dla WGA1
       -lub-
       5.0 µL polimerazy DNA WGA dla WGA2
2. Dokładnie wymieszaj, krótko odwiruj i rozpocznij termocykling.br>
3. Po zakończeniu cyklu, utrzymuj reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowuj w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do analizy lub oczyszczenia.
   

Reamplifikacja

1. Dodaj 10 µL 1 ng/mL amplifikowanego DNA WGA do probówki PCR lub płytki wielodołkowej.
   Uwaga: Konieczne jest oczyszczenie reakcji WGA w celu zmniejszenia możliwego błędu w reamplifikacji. Zalecamy użycie naszego zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (numer produktu NA1020) lub standardowych metod oczyszczania, które izolują jedno- i dwuniciowe DNA.
2. Utwórz mieszaninę amplifikacyjną. Dla każdej reakcji reamplifikacji dodaj następujące składniki do amplifikowanego DNA WGA (krok 1):
       47,5 µL wody wolnej od nukleaz
       7.5 µL 10X Amplification Master Mix
       5 µL WGA DNA Polymerase
3. Wiruj dokładnie, odwiruj krótko i rozpocznij termocykling. Poniższy profil został zoptymalizowany dla termocyklera PE 9700 lub równoważnego:
       Denaturacja początkowa 95 °C przez 3 minuty
       Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
           Denaturacja 94 °C przez 15 sekund
           Anneal/Extend 65 °C przez 5 minut
4. Po zakończeniu cyklu, utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C, aż będą gotowe do analizy lub oczyszczania. Stabilność DNA WGA jest równoważna genomowemu DNA przechowywanemu w tych samych warunkach.
   

Oczyszczanie amplifikowanych próbek wymazów z jamy ustnej

Oczyszczanie amplifikowanych produktów wykonywane przy użyciu zestawu GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. Włóż kolumnę wiążącą GenElute Miniprep (z niebieskim O-ringiem) do dostarczonej probówki zbiorczej, jeśli nie została jeszcze zmontowana. Dodaj 0,5 ml roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny miniprep i odwiruj przy 12 000 x g przez 30 sekund do 1 minuty. Odrzucić eluat.
   Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością.
2. Dodaj 5 objętości roztworu wiążącego do 1 objętości reakcji PCR i wymieszaj. Na przykład, dodaj 500 µL roztworu wiążącego do 100 µL reakcji PCR. Przenieś roztwór do kolumny wiążącej. Wirować kolumnę z maksymalną prędkością (12 000 do 16 000 x g) przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbierającą.
3. Włóż ponownie kolumnę wiążącą do probówki zbierającej. Nałożyć 0,5 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Odrzucić eluat, ale zachować probówkę zbiorczą.
   Uwaga: Przed pierwszym użyciem należy dodać etanol do koncentratu roztworu płuczącego. Patrz instrukcja przygotowania.
4. Włóż ponownie kolumnę do probówki zbiorczej. Odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty, bez dodatkowego roztworu płuczącego, aby usunąć nadmiar etanolu. Odrzuć wszelkie pozostałości eluatu, a także probówkę zbierającą.
5. Przenieś kolumnę do świeżej probówki zbierającej o pojemności 2 ml. Nałożyć 50 µL roztworu elucyjnego lub wody na środek każdej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
   Uwaga: Podczas elucji wodą należy upewnić się, że pH wody wynosi od 5,5 do 8,5. Elucję można również przeprowadzić przy użyciu roztworu elucyjnego rozcieńczonego 10-krotnie wodą.
6. Aby eluować DNA, odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Produkt amplifikacji PCR jest teraz obecny w eluacie i jest gotowy do natychmiastowego użycia lub przechowywania w temperaturze -20 °C.
   

Kwantyfikacja amplifikowanych próbek wymazu z policzka

Ilość DNA amplifikowanego przy użyciu amplifikacji całego genomu można wykryć z lub bez oczyszczania. Aby uzyskać najwyższą jakość próbek DNA, zdecydowanie zaleca się oczyszczenie próbek po amplifikacji. Amplifikowane produkty mogą być mierzone za pomocą testu PicoGreen^® dsDNA Quantitation Assay firmy Molecular Probes Inc (7589). Inną metodą wykrywania amplifikowanych produktów jest absorpcja spektrofotometryczna (OD260) na spektrofotometrze NanoDrop^® . Urządzenie to może mierzyć absorbancję na 1 μL próbki w szerokim zakresie dynamicznym (2-3 700 ng/μL).

Dane aplikacyjne dla amplifikacji próbki wymazu z jamy ustnej

Amplifikacja całego genomu przeprowadzona na próbce wymazu z jamy ustnej

Zamplifikowane produkty są wizualizowane na 1,5% żelu agarozowym. Do każdej studzienki załadowano 5 µL amplifikowanego produktu. Amplifikowane produkty GenomePlex mają średni rozmiar 400 bp. Wzór rozmazu różni się w zależności od źródła, jak pokazano na żelu.

Linia 1 - drabina 1 kb
Linia 2 - krew
Linia 3 - roślina
Linia 4 - wymaz z policzka
Linia 5 - gleba
Linia 6 - kontrola pozytywna
Linia 7 - drabina 1 kb

Wymagane materiały dodatkowe

• Wymazówka z policzka
• 1.Probówki do mikrowirówki o pojemności 5 mL
• Mikrowirówka (z rotorem na probówki o pojemności 2 mL)
• Łaźnia wodna o temperaturze 55 °C lub blok cieplny