Protokół ekstrakcji roślinnego DNA i amplifikacji WGA
Ekstrakcja DNA z tkanki roślinnej jest skomplikowanym procesem ze względu na twardą ścianę komórkową, która otacza większość komórek roślinnych. Genomowe DNA z materiału roślinnego może zostać uszkodzone podczas procesu ekstrakcji, co skutkuje niską wydajnością wysokiej jakości materiału genomowego. W rezultacie zdolność badacza do przeprowadzenia dalszej analizy jest ograniczona. GenomePlex® Whole Genome Amplification został użyty do amplifikacji genomowego DNA z soi, kukurydzy, pomidora, jeżówki purpurowej i żeń-szenia.
Do tej procedury zaleca się użycie zestawu GenElute™ Plant Genomic DNA Miniprep Kit (G2N10).
- Zmiel około 50 mg liści na drobny proszek za pomocą ciekłego azotu. Przechowywać próbkę na lodzie do natychmiastowego użycia lub zamrozić w temperaturze -70 °C.
- Dodać 350 μl Roztworu do Lizy (Część A) i 50 μl Roztworu do Lizy (Część B) i dokładnie wymieszać przez worteksowanie. Po dodaniu Roztworu do Lizy część B utworzy się biały osad.
- Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 10 minut, od czasu do czasu odwracając w celu rozpuszczenia osadu.
- Dodać 130 μl Roztworu do Wytrącania, wymieszać przez odwracanie i umieścić próbkę na lodzie na 5 minut.
- Wirować z maksymalną prędkością (12,000-16,000 × g) przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych, białek i polisacharydów.
- Uważnie odpipetuj supernatant na Kolumnę Filtracyjną GenElute™ (niebieska wkładka z 2 ml rurką zbierającą).
- Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzuć kolumnę filtracyjną i zachowaj probówkę.
- Dodaj 700 μl roztworu wiążącego bezpośrednio do przesączu (płyn z kroku 7). Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie.
- Włóż kolumnę wiążącą GenElute™ Miniprep (czerwony o-ring) do dostarczonej probówki do mikrowirówki.
- Dodaj 500 μl roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny Miniprep i odwiruj z prędkością 12 000 × g przez 1 minutę. Odrzuć przepływającą ciecz.
- Nanieś pipetą 700 μl przepływającej cieczy (z kroku 8) na kolumnę Miniprep przygotowaną w poprzednim kroku.
- Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę i odrzucić przepływającą ciecz.
- Nałożyć pozostały lizat (z kroku 8) i powtórzyć wirowanie przez 1 minutę z maksymalną prędkością i odrzucić przepływającą ciecz.
- Umieść kolumnę wiążącą w świeżej probówce o pojemności 2 ml i nałóż 500 μl rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę (pamiętaj o dodaniu etanolu do koncentratu roztworu płuczącego przed pierwszym użyciem).
- Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
- Dodaj kolejne 500 μl rozcieńczonego Roztworu Płuczącego do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością przez 3 minuty, aby osuszyć kolumnę.
- Przenieść kolumnę wiążącą do świeżej probówki zbierającej o pojemności 2 ml.
- Nałożyć 100 μl wstępnie ogrzanego (65 °C) Roztworu Elucyjnego na kolumnę i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Powtórzyć elucję.
- Przechowywać eluowane DNA w temperaturze -20 °C lub przejść do etapu amplifikacji przy użyciu WGA.
Uwaga: W przypadku korzystania z WGA2, nie ma potrzeby dostarczania polimerazy DNA, ponieważ enzym jest dostarczany wraz z zestawem.
Aplifikacja WGA
Protokół dla GenomePlex® Amplifikacja całego genomu przeprowadzana z GenomePlex® Whole Genome Amplification Kit (WGA1) i/lub Complete Whole Genome Amplification Kit (WGA2).
Fragmentacja
Przygotuj roztwór DNA o stężeniu 1 ng/µl z protokołu ekstrakcji krwi pełnej opisanego powyżej.
Dodaj 1 µl 10X buforu do fragmentacji do 10 µl DNA (1 ng/µl) w probówce PCR.
Umieść probówkę w termocyklerze w temperaturze 95 °C na dokładnie 4 minuty. Należy pamiętać, że inkubacja jest wrażliwa na czas i wszelkie odchylenia mogą zmienić wyniki.
Natychmiast schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.
Przygotowanie biblioteki
Dodać 2 µl 1x buforu do przygotowania biblioteki.
Dodać 1 µl roztworu stabilizującego bibliotekę.
Dokładnie wymieszać i umieścić w termocyklerze w temperaturze 95 °C na 2 minuty.
Schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.
Dodać 1 ml Library Preparation Enzyme, dokładnie wymieszać i krótko odwirować.
Umieścić próbkę w termocyklerze i inkubować w następujący sposób:
16 °C przez 20 minut
24 °C przez 20 minut
37 °C przez 20 minut
37 °C przez 20 minut
16 °C przez 20 minut.br> 75 °C przez 5 minut
4 °C hold
Wyjąć próbki z termocyklera i krótko odwirować. Próbki mogą być amplifikowane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -20 °C do trzech dni.
Amplifikacja
Dodaj następujące odczynniki do całej 15 µl reakcji:
7.5 µl 10x Amplification Master Mix
47,5 µl Nuclease Free Water
5.0 µl polimerazy DNA JumpStart Taq (12,5 jednostek) dla WGA1
-lub-
5.0 µl polimerazy DNA WGA dla WGA2
Dokładnie wymieszać, krótko odwirować i rozpocząć termocykling:
Denaturacja początkowa: 95 °C przez 3 minuty
Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
Denaturacja: 95 °C przez 15 sekund
Anneal/Extend: 65 °C przez 5 minut
Po zakończeniu cyklu utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania.
Reamplifikacja
- Dodaj 10 µl 1 ng/µl amplifikowanego DNA WGA do probówki PCR lub płytki wielodołkowej.
Uwaga: Konieczne jest oczyszczenie reakcji WGA w celu zmniejszenia możliwego błędu w reamplifikacji. Zalecamy użycie zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (numer produktu NA1020) lub standardowych metod oczyszczania, które izolują jedno- i dwuniciowe DNA.
- Utwórz mieszaninę amplifikacyjną. Dla każdej reakcji reamplifikacji dodaj następujące składniki do DNA amplifikowanego przez WGA (krok 1):
47,5 µl wody wolnej od nukleaz
7.5 µl 10X Amplification Master Mix
5 µl WGA DNA Polymerase
- Wiruj dokładnie, odwiruj krótko i rozpocznij termocykling. Poniższy profil został zoptymalizowany dla termocyklera PE 9700 lub równoważnego:
Denaturacja początkowa 95 °C przez 3 minuty
Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
Denaturacja 94 °C przez 15 sekund
Anneal/Extend 65 °C przez 5 minut
Po zakończeniu cyklu, utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania. Stabilność DNA WGA jest równoważna genomowemu DNA przechowywanemu w tych samych warunkach.
Oczyszczanie
Oczyszczanie produktów amplifikacji przeprowadzone przy użyciu zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (NA1020)
- Włóż kolumnę wiążącą GenElute™ Miniprep Binding Column (z niebieskim O-ringiem) do dostarczonej probówki zbiorczej, jeśli nie została jeszcze zmontowana. Dodaj 0,5 ml roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny miniprep i odwiruj z prędkością 12 000 x g przez 30 sekund do 1 minuty. Wyrzucić eluat.
Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością. - Dodaj 5 objętości roztworu wiążącego do 1 objętości reakcji PCR i wymieszaj. Na przykład, dodaj 500 ml Roztworu Wiążącego do 100 ml reakcji PCR. Przenieś roztwór do kolumny wiążącej. Wirować kolumnę z maksymalną prędkością (12 000 do 16 000 x g) przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbiorczą. Umieść ponownie kolumnę wiążącą w probówce.
- Nałóż 0,5 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę i wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbiorczą.
Uwaga: Pamiętaj, aby dodać etanol do koncentratu roztworu płuczącego przed pierwszym użyciem. Patrz instrukcja przygotowania. - Włóż ponownie kolumnę do probówki zbiorczej. Odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty, bez dodatkowego roztworu płuczącego, aby usunąć nadmiar etanolu. Odrzuć wszelkie pozostałości eluatu, a także probówkę zbierającą.
- Przenieś kolumnę do świeżej probówki zbierającej o pojemności 2 ml. Nałożyć 50 µl roztworu elucyjnego lub wody na środek każdej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
Uwaga: Podczas elucji wodą należy upewnić się, że pH wody wynosi od 5,5 do 8,5. Elucję można również przeprowadzić przy użyciu roztworu elucyjnego rozcieńczonego 10-krotnie wodą. - Aby eluować DNA, odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Produkt amplifikacji PCR jest teraz obecny w eluacie i jest gotowy do natychmiastowego użycia lub przechowywania w temperaturze -20 °C.
Kwantyfikacja amplifikowanych produktów
Ilość DNA amplifikowanego przy użyciu GenomePlex® Whole Genome Amplification może być wykryta z lub bez oczyszczania. W celu uzyskania najwyższej jakości próbek DNA zdecydowanie zaleca się oczyszczenie próbek po amplifikacji. Amplifikowane produkty mogą być mierzone za pomocą testu PicoGreen® dsDNA Quantitation Assay firmy Molecular Probes Inc. (#P-7589). Inną metodą wykrywania amplifikowanych produktów jest absorpcja spektrofotometryczna (OD260) na spektrofotometrze NanoDrop® . Przyrząd ten może mierzyć absorbancję na 1 μl próbki w szerokim zakresie dynamicznym, od 2-3700 ng/μl.
Rysunek 1. Amplifikacja całego genomu GenomePlex® przeprowadzona na próbkach roślinnych
GenomePlex® Amplifikacja całego genomu przeprowadzona na próbkach roślinnych
Zamplifikowane produkty są rozdzielane na 1,5% żelu agarozowym. Do każdej studzienki załadowano 5 μl amplifikowanego produktu. Produkty amplifikacji w GenomePlex® mają średnią wielkość 400 bp. Wzór rozmazu różni się w zależności od źródła, jak pokazano na żelu. Produkty amplifikowane przy użyciu GenomePlex® technologii są specyficzne, o czym świadczy brak sygnału w kontroli negatywnej (pas 3).
Linia 1-1 kb Marker
Linia 2-Kontrola pozytywna
Linia 3-Kontrola negatywna
Linia 4-Kukurydza
Pas 5 - Żeń-szeń
Pas 6 - Chaber purpurowy
Pas 7 - Pomidor
Pas 8 - Soja
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?Dla wygody naszych klientów ta strona została przetłumaczona maszynowo. Dołożyliśmy starań, aby zapewnić dokładne tłumaczenie maszynowe. Tłumaczenie maszynowe nie jest jednak doskonałe. Jeśli tłumaczenie maszynowe nie spełnia Twoich oczekiwań, przejdź do wersji w języku angielskim.