Protokół ekstrakcji roślinnego DNA i amplifikacji WGA

Ekstrakcja DNA z tkanki roślinnej jest skomplikowanym procesem ze względu na twardą ścianę komórkową, która otacza większość komórek roślinnych. Genomowe DNA z materiału roślinnego może zostać uszkodzone podczas procesu ekstrakcji, co skutkuje niską wydajnością wysokiej jakości materiału genomowego. W rezultacie zdolność badacza do przeprowadzenia dalszej analizy jest ograniczona. GenomePlex^® Whole Genome Amplification został użyty do amplifikacji genomowego DNA z soi, kukurydzy, pomidora, jeżówki purpurowej i żeń-szenia.

Do tej procedury zaleca się użycie zestawu GenElute™ Plant Genomic DNA Miniprep Kit (G2N10).

1. Zmiel około 50 mg liści na drobny proszek za pomocą ciekłego azotu. Przechowywać próbkę na lodzie do natychmiastowego użycia lub zamrozić w temperaturze -70 °C.
2. Dodać 350 μl Roztworu do Lizy (Część A) i 50 μl Roztworu do Lizy (Część B) i dokładnie wymieszać przez worteksowanie. Po dodaniu Roztworu do Lizy część B utworzy się biały osad.
3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 65 °C przez 10 minut, od czasu do czasu odwracając w celu rozpuszczenia osadu.
4. Dodać 130 μl Roztworu do Wytrącania, wymieszać przez odwracanie i umieścić próbkę na lodzie na 5 minut.
5. Wirować z maksymalną prędkością (12,000-16,000 × g) przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych, białek i polisacharydów.
6. Uważnie odpipetuj supernatant na Kolumnę Filtracyjną GenElute™ (niebieska wkładka z 2 ml rurką zbierającą).
7. Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Wyrzuć kolumnę filtracyjną i zachowaj probówkę.
8. Dodaj 700 μl roztworu wiążącego bezpośrednio do przesączu (płyn z kroku 7). Dokładnie wymieszaj przez odwrócenie.
9. Włóż kolumnę wiążącą GenElute™ Miniprep (czerwony o-ring) do dostarczonej probówki do mikrowirówki.
10. Dodaj 500 μl roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny Miniprep i odwiruj z prędkością 12 000 × g  przez 1 minutę. Odrzuć przepływającą ciecz.
11. Nanieś pipetą 700 μl przepływającej cieczy (z kroku 8) na kolumnę Miniprep przygotowaną w poprzednim kroku.
12. Wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę i odrzucić przepływającą ciecz.
13. Nałożyć pozostały lizat (z kroku 8) i powtórzyć wirowanie przez 1 minutę z maksymalną prędkością i odrzucić przepływającą ciecz.
14. Umieść kolumnę wiążącą w świeżej probówce o pojemności 2 ml i nałóż 500 μl rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę (pamiętaj o dodaniu etanolu do koncentratu roztworu płuczącego przed pierwszym użyciem).
15. Wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę.
16. Dodaj kolejne 500 μl rozcieńczonego Roztworu Płuczącego do kolumny i wiruj z maksymalną prędkością przez 3 minuty, aby osuszyć kolumnę.
17. Przenieść kolumnę wiążącą do świeżej probówki zbierającej o pojemności 2 ml.
18. Nałożyć 100 μl wstępnie ogrzanego (65 °C) Roztworu Elucyjnego na kolumnę i wirować z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Powtórzyć elucję.
19. Przechowywać eluowane DNA w temperaturze -20 °C lub przejść do etapu amplifikacji przy użyciu WGA.
    Uwaga: W przypadku korzystania z WGA2, nie ma potrzeby dostarczania polimerazy DNA, ponieważ enzym jest dostarczany wraz z zestawem.
    

Aplifikacja WGA

Protokół dla GenomePlex^® Amplifikacja całego genomu przeprowadzana z GenomePlex^® Whole Genome Amplification Kit (WGA1) i/lub Complete Whole Genome Amplification Kit (WGA2).

Fragmentacja

Przygotuj roztwór DNA o stężeniu 1 ng/µl z protokołu ekstrakcji krwi pełnej opisanego powyżej.

Dodaj 1 µl 10X buforu do fragmentacji do 10 µl DNA (1 ng/µl) w probówce PCR.

Umieść probówkę w termocyklerze w temperaturze 95 °C na dokładnie 4 minuty. Należy pamiętać, że inkubacja jest wrażliwa na czas i wszelkie odchylenia mogą zmienić wyniki.

Natychmiast schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.

Przygotowanie biblioteki

Dodać 2 µl 1x buforu do przygotowania biblioteki.

Dodać 1 µl roztworu stabilizującego bibliotekę.

Dokładnie wymieszać i umieścić w termocyklerze w temperaturze 95 °C na 2 minuty.

Schłodzić próbkę na lodzie i krótko odwirować.

Dodać 1 ml Library Preparation Enzyme, dokładnie wymieszać i krótko odwirować.

Umieścić próbkę w termocyklerze i inkubować w następujący sposób:

    16 °C przez 20 minut
    24 °C przez 20 minut
    37 °C przez 20 minut

    37 °C przez 20 minut
    16 °C przez 20 minut.br>     75 °C przez 5 minut
    4 °C hold

Wyjąć próbki z termocyklera i krótko odwirować. Próbki mogą być amplifikowane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -20 °C do trzech dni.

Amplifikacja

Dodaj następujące odczynniki do całej 15 µl reakcji:

    7.5 µl 10x Amplification Master Mix
    47,5 µl Nuclease Free Water
    5.0 µl polimerazy DNA JumpStart Taq (12,5 jednostek) dla WGA1
    -lub-
    5.0 µl polimerazy DNA WGA dla WGA2

Dokładnie wymieszać, krótko odwirować i rozpocząć termocykling:

    Denaturacja początkowa:     95 °C przez 3 minuty
    Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
    Denaturacja:                 95 °C przez 15 sekund
    Anneal/Extend:         65 °C przez 5 minut

Po zakończeniu cyklu utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania.

Reamplifikacja

1. Dodaj 10 µl 1 ng/µl amplifikowanego DNA WGA do probówki PCR lub płytki wielodołkowej.
   Uwaga: Konieczne jest oczyszczenie reakcji WGA w celu zmniejszenia możliwego błędu w reamplifikacji. Zalecamy użycie zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (numer produktu NA1020) lub standardowych metod oczyszczania, które izolują jedno- i dwuniciowe DNA.
   
   
2. Utwórz mieszaninę amplifikacyjną. Dla każdej reakcji reamplifikacji dodaj następujące składniki do DNA amplifikowanego przez WGA (krok 1):
   47,5 µl wody wolnej od nukleaz
   7.5 µl 10X Amplification Master Mix
   5 µl WGA DNA Polymerase
   
   
3. Wiruj dokładnie, odwiruj krótko i rozpocznij termocykling. Poniższy profil został zoptymalizowany dla termocyklera PE 9700 lub równoważnego:
   Denaturacja początkowa     95 °C przez 3 minuty
   Wykonaj 14 cykli w następujący sposób:
   Denaturacja               94 °C przez 15 sekund
   Anneal/Extend         65 °C przez 5 minut
   
   Po zakończeniu cyklu, utrzymywać reakcje w temperaturze 4 °C lub przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przygotowania do analizy lub oczyszczania. Stabilność DNA WGA jest równoważna genomowemu DNA przechowywanemu w tych samych warunkach.
   

Oczyszczanie

Oczyszczanie produktów amplifikacji przeprowadzone przy użyciu zestawu GenElute™ PCR Clean-Up Kit (NA1020)

1. Włóż kolumnę wiążącą GenElute™ Miniprep Binding Column (z niebieskim O-ringiem) do dostarczonej probówki zbiorczej, jeśli nie została jeszcze zmontowana. Dodaj 0,5 ml roztworu przygotowującego kolumnę do każdej kolumny miniprep i odwiruj z prędkością 12 000 x g przez 30 sekund do 1 minuty. Wyrzucić eluat.
   Uwaga: Roztwór przygotowujący kolumnę maksymalizuje wiązanie DNA z membraną, co skutkuje bardziej spójną wydajnością.
2. Dodaj 5 objętości roztworu wiążącego do 1 objętości reakcji PCR i wymieszaj. Na przykład, dodaj 500 ml Roztworu Wiążącego do 100 ml reakcji PCR.  Przenieś roztwór do kolumny wiążącej. Wirować kolumnę z maksymalną prędkością (12 000 do 16 000 x g) przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbiorczą. Umieść ponownie kolumnę wiążącą w probówce.
3. Nałóż 0,5 ml rozcieńczonego roztworu płuczącego na kolumnę i wiruj z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Odrzuć eluat, ale zachowaj probówkę zbiorczą.
   Uwaga: Pamiętaj, aby dodać etanol do koncentratu roztworu płuczącego przed pierwszym użyciem. Patrz instrukcja przygotowania.
4. Włóż ponownie kolumnę do probówki zbiorczej. Odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 2 minuty, bez dodatkowego roztworu płuczącego, aby usunąć nadmiar etanolu. Odrzuć wszelkie pozostałości eluatu, a także probówkę zbierającą.
5. Przenieś kolumnę do świeżej probówki zbierającej o pojemności 2 ml. Nałożyć 50 µl roztworu elucyjnego lub wody na środek każdej kolumny. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę.
   Uwaga: Podczas elucji wodą należy upewnić się, że pH wody wynosi od 5,5 do 8,5. Elucję można również przeprowadzić przy użyciu roztworu elucyjnego rozcieńczonego 10-krotnie wodą.
6. Aby eluować DNA, odwiruj kolumnę z maksymalną prędkością przez 1 minutę. Produkt amplifikacji PCR jest teraz obecny w eluacie i jest gotowy do natychmiastowego użycia lub przechowywania w temperaturze -20 °C.

Kwantyfikacja amplifikowanych produktów

Ilość DNA amplifikowanego przy użyciu GenomePlex^® Whole Genome Amplification może być wykryta z lub bez oczyszczania. W celu uzyskania najwyższej jakości próbek DNA zdecydowanie zaleca się oczyszczenie próbek po amplifikacji. Amplifikowane produkty mogą być mierzone za pomocą testu PicoGreen^® dsDNA Quantitation Assay firmy Molecular Probes Inc. (#P-7589). Inną metodą wykrywania amplifikowanych produktów jest absorpcja spektrofotometryczna (OD260) na spektrofotometrze NanoDrop^® . Przyrząd ten może mierzyć absorbancję na 1 μl próbki w szerokim zakresie dynamicznym, od 2-3700 ng/μl.

Rysunek 1. Amplifikacja całego genomu GenomePlex^® przeprowadzona na próbkach roślinnych

GenomePlex^® Amplifikacja całego genomu przeprowadzona na próbkach roślinnych

Zamplifikowane produkty są rozdzielane na 1,5% żelu agarozowym. Do każdej studzienki załadowano 5 μl amplifikowanego produktu. Produkty amplifikacji w GenomePlex^® mają średnią wielkość 400 bp. Wzór rozmazu różni się w zależności od źródła, jak pokazano na żelu. Produkty amplifikowane przy użyciu GenomePlex^® technologii są specyficzne, o czym świadczy brak sygnału w kontroli negatywnej (pas 3).

Linia 1-1 kb Marker
Linia 2-Kontrola pozytywna
Linia 3-Kontrola negatywna
Linia 4-Kukurydza
Pas 5 - Żeń-szeń
Pas 6 - Chaber purpurowy
Pas 7 - Pomidor
Pas 8 - Soja

Wymagane produkty

G2N10
W4502
WGA1
WGA2
WGA3
T9661
D9307

Materiały dostarczane przez użytkownika

Próbki roślinne
Mikrowirówka (z rotorem na probówki 2 ml)
Łaźnia wodna 55 °C lub blok cieplny