Analizy GC FAME przez elucję w temperaturze wrzenia

Michael D. Buchanan

Reporter EU Volume 34

mike.buchanan@sial.com

Wprowadzenie

Dla chemika żywności określenie składu kwasów tłuszczowych produktu może być trudne, ponieważ żywność może zawierać złożoną mieszaninę nasyconych, jednonienasyconych i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, z których każdy ma różne długości łańcucha węglowego. Wiele specjalistycznych produktów, takich jak kolumny GC i wzorce chemiczne, istnieje specjalnie do stosowania w ilościowej identyfikacji kwasów tłuszczowych. Każdy z tych produktów jest wytwarzany z myślą o chromatografach, aby pomóc im zapewnić dokładne i powtarzalne analizy.

Czytaj więcej

• Powiązane produkty.
  
• FAMEs by Boiling Point Elution
• GC Column Choices
• Chemical Standards
• Conclusion

FAMEs by Boiling Point Elution

GC może być stosowana do analizy kwasów tłuszczowych jako wolnych kwasów tłuszczowych lub jako estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Istnieją różne powody dla każdego z tych wyborów. Krótkołańcuchowe, bardziej lotne kwasy tłuszczowe są zazwyczaj analizowane w postaci wolnej przy użyciu specjalistycznych kolumn. Głównymi zaletami są łatwość/szybkość przygotowania próbki i brak artefaktów w analizie wynikających z procedury derywatyzacji. Kwasy tłuszczowe mogą być również analizowane jako estry metylowe kwasów tłuszczowych. Główne powody to:

• W swojej wolnej, niedostatecznie zobojętnionej formie, kwasy tłuszczowe mogą być trudne do analizy, ponieważ te wysoce polarne związki mają tendencję do tworzenia wiązań wodorowych, co prowadzi do problemów z adsorpcją. Zmniejszenie ich polarności może sprawić, że będą bardziej podatne na analizę.
• Aby rozróżnić bardzo niewielkie różnice wykazywane przez nienasycone kwasy tłuszczowe, polarne karboksylowe grupy funkcyjne muszą najpierw zostać zneutralizowane. Umożliwia to następnie chemię kolumn w celu przeprowadzenia separacji według elucji temperatury wrzenia, a także stopnia, położenia, a nawet konfiguracji nienasycenia cis vs. trans.

Poprzedni artykuł w tym Reporterze obejmuje analizę wolnych kwasów tłuszczowych¹. Poprzednie artykuły Reportera szczegółowo opisywały analizę GC kwasów tłuszczowych omega 3 i omega 6 jako FAMEs oraz izomerów cis/trans kwasów tłuszczowych jako FAMEs^2-3. W tym artykule skupimy się na analizie FAME za pomocą elucji w temperaturze wrzenia, stosowanej do rozpoznawania wzorców. Technika ta jest przydatna do:

• Określania źródła kwasów tłuszczowych w porównaniu do wzorców/profili ze znanych źródeł, z których każdy ma unikalny rozkład kwasów tłuszczowych. Analiza jakościowa i ilościowa ma fundamentalne znaczenie dla producentów żywności w zakresie kontroli jakości, określania czystości i wykrywania substancji zafałszowujących.
• Obserwowanie subtelnych różnic między próbkami, co pozwala wykryć wpływ na metabolizm kwasów tłuszczowych, spowodowany wpływami zewnętrznymi lub wewnętrznymi. Ten rozwijający się obszar badań jest powszechnie określany jako metabolomika i rozciąga się na klasy związków poza kwasami tłuszczowymi.

GC Column Choices

Rozdzielenie analitów w elucji w temperaturze wrzenia wymaga użycia niepolarnej kolumny GC. Equity-1, wytrzymała kolumna niepolarna, może być używana do tego zastosowania z dużym powodzeniem. Specyfikacje kolumn dla Equity-1 przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Kolumny kapilarne GC Equity-1

Zastosowanie:

Kolumna ta jest przeznaczona do zastosowań, w których wymagana jest kolumna niepolarna.Anality będą rozdzielane głównie zgodnie z temperaturą wrzenia.

Kod USP:

Kolumna spełnia wymagania USP G1, G2 i G9.

Polimer:

Bonded; poly(dimethylsiloxane)

Temp. Ograniczenia:

-60 oC do 325/350 oC dla 0.10-0.32 mm I.D.

-60 oC do 300/320 oC dla 0.53 mm I.D. (<1.5 μm)

-60 oC do 260/280 oC dla 0.53 mm I.D. (>1.5 μm)

Chromatogram kolumny Supelco 37-Component FAME Mix na Equity-1 przedstawiono na Rysunku 1. Jak pokazano, kolumna ta posiada niezbędną chemię kolumny do analizy nasyconych, nienasyconych i wielonienasyconych FAME, o długości łańcucha od C4 do C24, z doskonałymi kształtami pików. Rysunek 2 pokazuje analizę estrów metylowych kwasów bakteryjnych (BAME) na Equity-1. Ta mieszanka C10-C20 zawiera hydroksylo-FAME i rozgałęzione FAME oprócz nasyconych, nienasyconych i wielonienasyconych FAME. Ponownie zaobserwowano doskonały kształt piku dla wszystkich analitów.

Kolumna: Equity-1, 15 m x 0,10 mm 1.0., 0,10 µm (28039-U)
piec: 100 °C, 50 °C/min. do 300 °C (1 min.)
inj.: 250 °C
det. FID, 300 °C
gaz nośny: wodór, stała 50 cm/s
wtrysk: 0,2 µl, split 200:1
liner: 4 mm I.D., split, cup design
sample: Supelco 37-Component FAME Mix (CRM47885), anality w stężeniach wskazanych w chlorku metylenu

1. Ester metylowy kwasu masłowego (C4:0) w stężeniu 4% wagowych
2. Ester metylowy kwasu kapronowego (C6:0) w stężeniu 4% wagowych
3. Ester metylowy kwasu kaprylowego (C8:0) w stężeniu 4% wagowych
4. Ester metylowy kwasu kaprynowego (C10:0) w stężeniu 4% wagowych
5. Ester metylowy kwasu indekanowego (C11:0) w stężeniu 2% wagowych
6. Ester metylowy kwasu laurynowego (C12:0) w stężeniu 4% wagowych
7. Ester metylowy kwasu tridekanowego (C13:0) w stężeniu 2% wagowych
8. Ester metylowy kwasu mirystynowego (C14:0) w stężeniu 4% wagowych
9. Ester metylowy kwasu mirystalowego (C14:1) w stężeniu 2% wagowych
10.  Ester metylowy kwasu pentadekanowego (C15:0) w stężeniu 2% wagowych.Ester metylowy kwasu pentadekenowego (C15:1) w stężeniu 2% wagowych
11. Ester metylowy kwasu palmitynowego (C16:0) w stężeniu 6% wagowych
12. Ester metylowy kwasu palmitooleinowego (C16:1) w stężeniu 2% wagowych
13. Ester metylowy kwasu heptadekanowego (C17:0) w stężeniu 2% wagowych
14. Ester metylowy kwasu cis-10-heptadekenowego (C17:1) w stężeniu 2% wagowych
15. Ester metylowy kwasu stearynowego (C18:0) w stężeniu 4% wagowych
16. Ester metylowy kwasu oleinowego (C18:1n9c) w stężeniu 4% wag 
17. Ester metylowy kwasu oleinowego (C18:1n9t) w stężeniu 2% wag
18. Ester metylowy kwasu linolowego (C18:2n6c) w stężeniu 2% wagowych
19. Ester metylowy kwasu linolowego (C18:2n6t) w stężeniu 2% wagowych
20. Ester metylowy kwasu linolenowego (C18:3n6) w stężeniu 2% wagowych
21. ester metylowy kwasu a-linolenowego (C18:3n3) w stężeniu 2% wagowych
22. ester metylowy kwasu arachidowego (C20:0) w stężeniu 4% wagowych
23. ester metylowy kwasu cis-11-enosenowego (C20:1n9) w stężeniu 2. % wagowych
24. ester metylowy kwasu cis-11,14-enosadienowego (C20:2) w stężeniu 2 % wagowych
25. ester metylowy kwasu cis-8,11,14-enosatrienowego (C20:3n6) w stężeniu 2% wagowych
26. ester metylowy kwasu cis-11,14,17-ikozatrienowego (C20:3n3) w stężeniu 2% wagowych
27. ester metylowy kwasu arachidonowego (C20:486) w stężeniu 2% wagowych
28. ester metylowy kwasu cis-5,8,11,14,17-ikozapentaenowego (C20:5n3) w stężeniu 2% wagowych
29. Ester metylowy kwasu heenoizanowego (C21:0) w stężeniu 2% wagowych
30. Ester metylowy kwasu behenowego (C22:0) w stężeniu 4% wagowych
31. Ester metylowy kwasu erukowego (C22:1n9) w stężeniu 2% wagowych
32. Ester metylowy kwasu cis-13,16-dokosadienowego (C22:2) w stężeniu 2% wagowych;
33. ester metylowy kwasu 4,7,10,13,16,19-dokozaheksaenowego (C22:6n3) w stężeniu 2% wagowych
34. Ester metylowy kwasu trikozanowego (C23:0) w stężeniu 2% wagowych
35. Ester metylowy kwasu lignocerynowego (C24:0) w ilości 4% wagowych
36. Ester metylowy kwasu nerwonowego (C24:19) w ilości 2% wagowych

Rysunek 1. 37-składnikowa mieszanka FAME na Equity-1

Kolumna: Equity-1, 15 m x 0,10 mm I.D., 0,10 µm (28039-U)
piec: 175 °C, 30 °C/min. do 275 °C (1 min.)
inj: 280 °C
det: FID, 280 °C
gaz nośny: wodór, stała 45 cm/s
wtrysk: 0,5 µL, 200:1 split
liner: 4 mm I.D., split, cup design
sample: Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix (47080-U), pochodne estrów metylowych naturalnie występującej mieszaniny bakteryjnych kwasów tłuszczowych, całkowite stężenie 10 mg/ml w kapronianie metylu

1. 2-hydroksydekanian metylu (2-OH-C10:0)
2. Niedekanian metylu (C11:0)
3. Dodekanian metylu (C12:0)
4. 2-hydroksydodekanian metylu (2-OH-C12:0)
5. 3-hydroksydodekanian metylu (3-OH-C12:0)
6. tridekanian metylu (C13:0)
7. tetradekanian metylu (C14:0)
8. 2-hydroksytetradekanian metylu (2-OH-C14:0)
9. 3-hydroksytetradekanian metylu (3-OH-C14:0)
10. pentadekanian metylu (C15:0)
11. 13-metylotetradekanian metylu (i-C15:0)
12. 12-metylotetradekanian metylu (a-C15:0)
13. Heksadekanian metylu (C16:0)
14. 14-metylopentadekanian metylu (1-C16:0)
15. 2-hydroksyheksadekanian metylu (2-OH-C16:0)
16. Cis-9-heksadekanian metylu (C16:19)
17. Heptadekanian metylu (C17:0)
18. 15-metyloheksadekanian metylu (i-C17:0)
19. Cis-9,10-metyloheksadekanian metylu (C17:0D)
20. Oktadekanian metylu (C18:0)
21. oktadekanian cis-9-metylu (C18:19)
22. oktadekanian trans-9-metylu (C18:19) i
23. Cis-11-oktadekenian metylu (C18:111)
24. Cis-9,12-oktadekadienoinian metylu (C18:29,12)
25. Nonadekanian metylu (C19:0)
26. Cis-9,10-metylenoktadekanian metylu (C19:0D)
27. Eikozanian metylu (C20:0)

Rysunek 2. Estry metylowe kwasów bakteryjnych (BAME) na Equity-1

Zauważ, że oba przedstawione chromatogramy wykorzystują warunki Fast GC: krótką kolumnę z wąskim I.D., wysoką prędkość liniową gazu nośnego i szybkie programowanie temperatury pieca. Kolumny o tradycyjnych wymiarach (np. 30 m x 0,25 mm wewn, 0,25 μm) mogą być również używane do tych zastosowań z równym powodzeniem.

Chemical Standards

Aby przypisać identyfikację podczas wykonywania elucji w temperaturze wrzenia estrów metylowych kwasów tłuszczowych w celu rozpoznania wzorca, należy użyć wzorców o znanym odniesieniu. Aby pomóc w potwierdzeniu identyfikacji, Supelco oferuje kilka odpowiednich standardów. Wybrane standardy można znaleźć w wykazie produktów na końcu tego artykułu. Jednym ze standardów jest Supelco 37-Component FAME Mix (CRM47885). Standard ten zawiera estry metylowe kwasów tłuszczowych w zakresie od C4 do C24, w tym kluczowe jedno- i wielonienasycone kwasy tłuszczowe, dzięki czemu jest bardzo przydatny dla analityków żywności, ponieważ może być stosowany do identyfikacji kwasów tłuszczowych w wielu różnych rodzajach żywności.

Oferowane są wysoko scharakteryzowane oleje referencyjne, które mogą być stosowane jako kontrole lub próbki kontrolne, zapewniając doskonały sposób standaryzacji aplikacji i porównywania wyników z innymi. Dostępne są również mieszanki referencyjne AOCS dla zwierząt i warzyw. Każda mieszanka ilościowa jest podobna do rozkładu kwasów tłuszczowych niektórych olejów, jak określono w artykule dotyczącym mieszanek referencyjnych AOCS na stronie 22, i jest zgodna z wymaganiami metody AOCS Ce 1-62.

Conclusion

Pomiar i raportowanie zawartości kwasów tłuszczowych w żywności jest ważnym krokiem, który pozwala konsumentom na ustalenie zdrowej strategii żywieniowej. Kapilarne kolumny GC Equity-1 i specjalnie opracowane wzorce chemiczne są odpowiednie do zastosowania przedstawionego w tym artykule, analizy GC FAME poprzez elucję w temperaturze wrzenia.

Ten artykuł, te w poprzednich wydaniach Reportera, oraz sigma-aldrich.com/fame strona internetowa ilustruje szeroki zakres specjalistycznych kolumn GC i szeroką gamę specjalnie opracowanych wzorców chemicznych, które są dostępne do analiz kwasów tłuszczowych i FAME. Dzięki niezrównanej wiedzy i ofercie produktów, jesteśmy naprawdę kompleksowym rozwiązaniem dla uzyskania doskonałych produktów do analiz GC kwasów tłuszczowych z żywności dla potrzeb żywieniowych.

Referencje

1. Buchanan M. 2009. Supelco Reporter. 34 15–16.

2. Sidisky L, Stenerson K, Baney G, Buchanan M. March 2008 . Supelco Reporter Vol. 30 16–18. [Internet]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Supelco/The_Reporter/1/T215004.pdf

3. Buchanan M. Jan 2008. Reporter. 2916–17.