Długa i dokładna reakcja PCR z RedAccuTaq^®

Instrukcje przygotowania

Optymalizacja reakcji
Niezawodna amplifikacja długich sekwencji DNA wymaga: 1) skutecznej denaturacji matrycy DNA, 2) odpowiednich czasów wydłużania w celu wytworzenia dużych produktów i 3) ochrony docelowego DNA przed uszkodzeniem przez depurynację. Skuteczna denaturacja jest osiągana przez zastosowanie wyższych temperatur przez krótsze okresy czasu lub przez zastosowanie współrozpuszczalników, takich jak dimetylosulfotlenek. Dodanie DMSO w reakcji w końcowym stężeniu od 1 do 4% może zwiększyć wydajność i poprawić niezawodność systemu z niektórymi złożonymi celami PCR. Betaina (0,8-1,3 M) została zgłoszona w celu poprawy amplifikacji DNA poprzez zmniejszenie tworzenia struktury drugorzędowej w regionach bogatych w GC.¹

Cykler termiczny
Do opracowania parametrów cyklu wykorzystano cykler Perkin-Elmer GeneAmp 2400. Inne typy cyklerów termicznych mogą być również używane, ale mogą wymagać dalszej optymalizacji parametrów cyklu.

Projekt primerów
Primery mają zwykle długość od 21 do 34 zasad i są zaprojektowane tak, aby miały zawartość GC 45-50%. Optymalnie, temperatury topnienia starterów do przodu i do tyłu powinny mieścić się w zakresie 3 °C od siebie, a Tm starterów powinien wynosić 65-72 °C.² Startery nie powinny mieć żadnych wewnętrznych sekwencji parowania zasad (tj. potencjalnych spinek do włosów) ani żadnych znaczących długości regionów komplementarnych między dwoma starterami PCR. Czasami pomocne jest zaprojektowanie starterów z końcowym CC, GG, CG lub GC na 3-pierwotnym końcu starterów w celu zwiększenia wydajności primingu.³

Szablon
Wysoka jakość i odpowiednia długość szablonu są niezbędne do niezawodnej amplifikacji większych fragmentów. Należy zachować szczególną ostrożność podczas przygotowywania i obsługi docelowego DNA do długiej reakcji PCR. Nacięte lub uszkodzone DNA może służyć jako potencjalne miejsce primingu, powodując wysokie tło. Należy unikać zamrażania lub, alternatywnie, zamrażać tylko raz, aby zminimalizować uszkodzenia. Stan docelowego DNA jest krytyczny. Depurynacja podczas cykli jest zminimalizowana poprzez zastosowanie buforów o pH wyższym niż 9,0 w temperaturze 25°C.

Stężenie magnezu
Optymalizacja stężenia magnezu może być konieczna. Ogólnie stężenie magnezu powinno wynosić od 1 do 5 mM.

Warunki cyklu
Temperatura przedłużania powinna być ograniczona do 68 °C w celu uzyskania optymalnej wydajności. Temperatury wyższe niż 68 ° C mogą skutkować zmniejszoną ilością lub brakiem produktu. Dla celów większych niż 20-kb, czas wydłużania powinien być dłuższy niż 20 minut. Wyżarzanie starterów i wydłużanie produktu można również połączyć w jeden etap, jeśli startery są zaprojektowane tak, aby miały Tm między 65-68 ° C. Zaleca się stosowanie automatycznego wydłużania w celu zmniejszenia artefaktów. Czasy denaturacji cyklu powinny być krótkie. Na przykład początkowa denaturacja DNA może być przeprowadzona przez 30-sekundową inkubację w temperaturze 96°C.

Przygotowanie buforu
Bufor AccuTaq LA 10x ma stosunkowo wysokie pH, a magnez może wytrącać się jako wodorotlenek magnezu [Mg(OH)₂]. Przed użyciem należy rozmrozić bufor w temperaturze pokojowej, a następnie worteksować w celu ponownego rozpuszczenia wytrąconego Mg(OH)₂. Alternatywnie, podgrzać bufor w temperaturze 37°C przez 3-5 minut, a następnie worteksować.

Procedura amplifikacji
Optymalne warunki dla stężenia polimerazy DNA REDAccuTaq LA, matrycy DNA, starterów i MgCl₂ będą zależeć od używanego systemu. Konieczne może być określenie optymalnych warunków dla każdego pojedynczego składnika.

1. Dodaj następujące odczynniki do cienkościennej 200 µl lub 500 µL probówki mikrowirówki PCR:

Objętość	Odczynnik	Stężenie końcowe
5 µL	AccuTaq LA 10x Buffer	1X
2.5 µL	dNTP Mix D7295	500 µM
- µL	Template DNA*	4 ng/µL
- µL	Forward Primer	0.1-1 µM
- µL	Reverse Primer	0.1-1 µM
- µL	Woda	----
2.5 µL	REDAccuTaq LA DNA Polymerase Mix (D4812)	0.05 jednostek/µL
50 µL całkowitej objętości

*Typowo ≥200 ng matrycowego DNA jest niezbędne do amplifikacji bardziej złożonych genomów.

2. Delikatnie wymieszać i krótko odwirować, aby zebrać wszystkie składniki na dnie probówki.

3. Dodać 50 µL oleju mineralnego do górnej części każdej probówki, aby zapobiec parowaniu (opcjonalnie, w zależności od modelu termocyklera).

4. Parametry amplifikacji powinny być zoptymalizowane dla poszczególnych starterów, matrycy i termocyklera. Sugerowane parametry cyklu oparte na własnej amplifikacji DNA lambda i 20kb fragmentu ludzkiego klastra genu β-globiny:

Inicjacyjna denaturacja	98 °C 30 sek
Dla cyklu 1-15:
Denaturacja	94 °C 5-15 sek
Wygrzewanie	65 °C 20 sek
Wydłużanie	68 °C 20 min
Dla cyklu 16-30:
Denaturacja	94 °C 5-15 sek
Wygrzewanie	65 °C 20 sek
Wydłużanie	68 °C 20 min + 15 sek/cykl
Wydłużanie końcowe:	68 °C 20 min
Hold	4 °C

5. Ocenić amplifikowane DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie barwienia bromkiem etydyny.⁴

Uwagi:
a. Podczas amplifikacji szablonów o długości 20 kb lub większej, sugerowane jest 15-sekundowe automatyczne wydłużanie dla cykli 16-30. Niektóre termocyklery mogą nie mieć tej funkcji automatycznego wydłużania; zaleca się wydłużanie czasu wydłużania o 1-4 minuty.

b. Podczas amplifikacji fragmentów mniejszych niż 20 kb, czas wydłużania można skrócić w zależności od wielkości fragmentu. Zwykle jedna minuta przedłużania będzie wystarczająca dla fragmentu 1 kb.

Przewodnik rozwiązywania problemów

Problem	Możliwe przyczyny	Rozwiązanie
Nie zaobserwowano produktu PCR	Może brakować składnika PCR lub może on być zdegradowany.	Kontrola pozytywna powinna być zawsze wykonywana, aby upewnić się, że komponenty działają. Lista kontrolna jest również zalecana podczas składania reakcji.
	Może być wykonanych zbyt mało cykli.	Zwiększ liczbę cykli (3-5 dodatkowych cykli na raz).
	Temperatura wyżarzania może być zbyt wysoka.	Zmniejsz temperaturę wyżarzania w krokach co 2-4 °C.
	Startery mogą nie być zaprojektowane optymalnie.	Potwierdź dokładność informacji o sekwencji. Jeśli startery mają mniej niż 27 nukleotydów, spróbuj wydłużyć starter do 27-33 nukleotydów. Jeśli starter ma zawartość GC mniejszą niż 45%, spróbuj przeprojektować starter z zawartością GC 45-60%.
	Może nie być wystarczającej ilości szablonu.	Po zwiększeniu liczby cykli bez powodzenia, powtórz reakcję z wyższym stężeniem matrycy.
	Szablon może być niskiej jakości.	Oceń integralność szablonu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Może być konieczne ponowne oczyszczenie szablonu przy użyciu metod minimalizujących ścinanie i nacinanie.
	Temperatura denaturacji może być zbyt wysoka lub zbyt niska.	Zoptymalizuj temperaturę denaturacji, zwiększając lub zmniejszając temperaturę w krokach co 1 °C.
	Czas denaturacji może być zbyt długi lub zbyt krótki.	Zoptymalizuj czas denaturacji, zwiększając lub zmniejszając go w odstępach co 10 sekund.
	Czas przedłużania może być zbyt krótki.	Zwiększaj czas przedłużania co 2 minuty, szczególnie w przypadku długich szablonów.
	Reakcja może nie zawierać wystarczającej ilości enzymu.	0,05 jednostki/µL jest wystarczające dla większości zastosowań. Zaleca się optymalizację parametrów cyklu przed zwiększeniem stężenia enzymu. W rzadkich przypadkach wydajność można poprawić poprzez zwiększenie stężenia enzymu. Jednakże, jeśli ilość enzymu przekracza 0,10 jednostek/µL, mogą być widoczne wyższe poziomy tła.
	Poziomy Mg++ mogą być nieoptymalne.	Jest to mało prawdopodobne, jeśli używany jest bufor reakcyjny 10X (z MgCl2), a deoksynukleotydy nie przekraczają stężenia 0.6 mM każdy (ponieważ trifosforany deoksynukleotydów mogą wiązać Mg++). Zazwyczaj MgCl2 jest optymalizowany w zakresie od 1 do 5 mM. Ponadto EDTA obecny w próbce w ilości większej niż 5 mM zmniejszy efektywne stężenie magnezu.
	Ilości deoksynukleotydów są zbyt niskie.	Jest to mało prawdopodobne, jeśli końcowe stężenie każdego deoksynukleotydu wynosi 0,5 mM. Takie stężenie dNTP jest odpowiednie dla szerokiego zakresu zastosowań. Jeśli dNTP są przygotowywane w laboratorium, należy upewnić się, że końcowe stężenie każdego deoksynukleotydu wynosi 0,5 mM. Jeśli stężenie dNTPs zostanie zwiększone, stężenie Mg++ będzie musiało zostać proporcjonalnie zwiększone.
	Szablon docelowy jest trudny.	W większości przypadków, z natury trudne cele są spowodowane niezwykle wysoką zawartością GC i / lub strukturą drugorzędową. Stwierdzono, że betaina pomaga w amplifikacji szablonów o wysokiej zawartości GC w stężeniu 0,8-1,3 M. W niektórych przypadkach pomocne może być dodanie 1-4% DMSO.
	Produkt PCR wypłynął ze studzienki podczas bezpośredniego ładowania do żelu.	Użyj zalecanej ilości polimerazy DNA REDAccuTaq LA (2.5 µL na 50 µL reakcji), aby zapewnić wystarczającą ilość glicerolu do prawidłowego załadowania produktu PCR bezpośrednio do żelu.
	Może być wykonanych zbyt wiele cykli.	Zmniejszając liczbę cykli, można wyeliminować niespecyficzne pasma.
	Temperatura annealingu może być zbyt niska.	Zwiększ temperaturę wyżarzania/rozszerzania w krokach co 2-3 °C.
	Startery mogą nie być zaprojektowane optymalnie.	Potwierdź dokładność informacji o sekwencji. Jeśli długość starterów jest mniejsza niż 27 nukleotydów, spróbuj wydłużyć startery do 27-33 nukleotydów. Jeśli starter ma zawartość GC mniejszą niż 45%, spróbuj przeprojektować startery z zawartością GC 45-60%.
	Może być potrzebna reakcja PCR.	"Touchdown" PCR znacząco poprawia specyficzność wielu reakcji PCR w różnych zastosowaniach. Touchdown PCR polega na użyciu temperatury wyżarzania/rozszerzania, która jest wyższa niż Tm starterów podczas początkowych cykli PCR. Temperatura wyżarzania/rozciągania jest następnie obniżana do Tm starterów dla pozostałych cykli PCR. Zmianę można przeprowadzić w jednym kroku lub stopniowo w kilku cyklach.5
	Mogło zostać wykonanych zbyt wiele cykli.	Zmniejsz liczbę cykli w odstępach co 3-5 cykli.
	Temperatura denaturacji może być zbyt niska.	Zwiększ temperaturę denaturacji w krokach co 1°C.
	Czas przedłużania może być zbyt długi.	Zmniejszaj czas przedłużania w 1-2 minutowych przyrostach
	Może być potrzebna reakcja PCR typu touchdown.	Patrz zalecenia w sekcji "Wiele produktów" dotyczące procedury.
	Może być zbyt dużo enzymu w mieszaninie reakcyjnej.	0,05 jednostki/µL jest wystarczające dla większości zastosowań. Stężenie to może być jednak zbyt wysokie dla niektórych zastosowań. Zaleca się najpierw zoptymalizować parametry cyklu, jak opisano powyżej, a następnie zmniejszyć stężenie enzymu do 0,5-0,2X.
	Stężenie magnezu może być zbyt wysokie.	Stężenie MgCl2 powinno być zoptymalizowane. Zazwyczaj stężenie MgCl2 jest optymalne w zakresie od 1 do 5 mM. Jeśli stężenie dNTP wynosi 0,5 mM, jest bardzo mało prawdopodobne, że stężenie magnezu jest zbyt wysokie.
	Stężenie szablonu może być zbyt wysokie.	Zmniejsz stężenie matrycy w reakcji PCR.
	Startery mogą nie być zaprojektowane optymalnie.	Patrz zalecenia w sekcji "Wiele produktów".
	Czas wydłużania może być zbyt krótki.	Zwiększ czas wydłużania w odstępach 2-minutowych lub użyj PCR z przyłożeniem.
	Stężenie szablonu może być zbyt niskie.	Dodaj dodatkową matrycę w przyrostach co 50 ng dla genomowego DNA lub 1-2 ng dla wirusowego DNA.
	Może być wykonana zbyt mała liczba cykli.	Zwiększ liczbę cykli w odstępach co 3-5 cykli
	Czas przedłużenia może być zbyt krótki.	Zwiększaj czas wydłużania w odstępach co 2 minuty
Może być wymagany współrozpuszczalnik	Dodaj dimetylosulfotlenek (1-4%) lub 0.8-1,3 M betainy w końcowym stężeniu.

Referencje

1. Rees WA, Yager TD, Korte J, Von Hippel PH. 1993. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry. 32(1):137-144. https://doi.org/10.1021/bi00052a019

2. Rychlik W, Rhoads RE. 1989. A computer program for choosing optimal oligonudeotides for filter hybridization, sequencing andin vitroamplification of DNA. Nucl Acids Res. 17(21):8543-8551. https://doi.org/10.1093/nar/17.21.8543

3. Lowe T, Sharefkin J, Yang SQ, Dieffenbach CW. 1990. A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reactions. Nucl Acids Res. 18(7):1757-1761. https://doi.org/10.1093/nar/18.7.1757

4.  Sambrook, J, et al.,  Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2000), Catalog Number M8265.  JeaMCALMTECSHLPNY(CNM.

5. Don R, Cox PT, Wainwright B, Baker K, Mattick JS. 1991. ?Touchdown? PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucl Acids Res. 19(14):4008-4008. https://doi.org/10.1093/nar/19.14.4008

6. Barnes WM. 1994. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(6):2216-2220. https://doi.org/10.1073/pnas.91.6.2216

7. Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. 1994. Effective amplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91(12):5695-5699. https://doi.org/10.1073/pnas.91.12.5695

8. Roux KH. 1995. Optimization and troubleshooting in PCR.. Genome Research. 4(5):S185-S194. https://doi.org/10.1101/gr.4.5.s185

9. Frey, B., and Suppmann, B., Demonstration of the Expandä PCR system’s greater fidelity and higher yields with a lacl-based PCR fidelity assay. Biochemica, 2, 8-9 (1995) FBaSBDotEPsgfahywalPfaB28(.

10. PCR Technology: Current Innovations, Griffin, H. G., and Griffin, A. M., (Eds.) (CRC Press, Boca Raton, FL, 1994). PTCIGHGaGAM((PBRF1.

11. PCR Strategies, Innis, M. A., et al. (Eds.) (Academic Press, New York, 1995). PSIMAea((PNY1.

12. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M., et al. (Eds.) (Academic Press, San Diego, California, 1990). Catalog No. P8177 PPAGtMaAIMea((PSDC1CNP.

13. Nelson, et al. The fidelity of TaqPlus™ DNA Polymerase in PCR. Strategies Mol. Biol., 8, 24-25 (1995). NeaTfoTDPiPSMB82(.

14. PCR: Essential Data Series, Newton, C. R., (Ed.) (John Wiley & Sons, New York, 1995). Catalog No. Z364916 . PEDSNCR((W&SNY1CNZ..

15. Roux KH. 1995. Optimization and troubleshooting in PCR.. Genome Research. 4(5):S185-S194. https://doi.org/10.1101/gr.4.5.s185

REDAccuTaq jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Sigma-Aldrich Co. LLC
TWEEN jest zastrzeżonym znakiem towarowym Croda International PLC
IGEPAL jest zastrzeżonym znakiem towarowym Rhodia Operations.

UWAGA DLA NABYWCY: OGRANICZONA LICENCJA

Korzystanie z tego produktu jest objęte co najmniej jednym z następujących patentów USA i odpowiadających im zastrzeżeń patentowych poza USA:  5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 oraz zastrzeżenia poza USA odpowiadające wygasłemu patentowi USA nr. 5,079,352. Zakup tego produktu obejmuje ograniczone, niezbywalne zwolnienie z roszczeń wynikających z powyższych zastrzeżeń patentowych w przypadku użycia wyłącznie tej ilości produktu do własnych badań wewnętrznych nabywcy. Żadne prawo wynikające z jakiegokolwiek innego zastrzeżenia patentowego, żadne prawo do wykonywania jakiejkolwiek opatentowanej metody ani żadne prawo do świadczenia usług komercyjnych jakiegokolwiek rodzaju, w tym między innymi do zgłaszania wyników działań nabywcy za opłatą lub innym wynagrodzeniem komercyjnym, nie jest przekazywane w sposób wyraźny, dorozumiany ani przez estoppel. Niniejszy produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku badawczego. Zastosowania diagnostyczne objęte patentami Roche wymagają odrębnej licencji od Roche. Więcej informacji na temat zakupu licencji można uzyskać, kontaktując się z dyrektorem ds. licencjonowania, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA.