Protokół wyżarzania oligonukleotydów

• Abbreviations
• Dna / Rna Annealing Equipment And Supplies
• Metoda wyżarzania DNA / RNA
• Przepisy na bufory do wyżarzania DNA

Ten protokół służy do annealingu dwóch jednoniciowych oligonukleotydów o komplementarnych sekwencjach (Rysunek 1). Ogrzewanie, a następnie chłodzenie ułatwia hybrydyzację.

Rysunek 1. Przykład reakcji wyżarzania. Ciepło "przerywa" wszystkie wiązania wodorowe, zakłócając w ten sposób strukturę drugorzędową w każdym oligonukleotydzie. Powolne chłodzenie ułatwia hybrydyzację, ponieważ między komplementarnymi sekwencjami tworzą się nowe wiązania wodorowe.

Definicje / skróty

EDTA: kwas etylenodiaminotetraoctowy

NaCl: chlorek sodu

Trizma^® base:  Nazwa marki Tris [Tris(hydroksymetylo)aminometan]

Oligo: Skrót od oligonukleotyd lub oligomer. Oligonukleotydy to krótkie, jednoniciowe cząsteczki DNA lub RNA, które muszą zostać wyżarzone (podgrzane lub stopione), aby mogły związać się i utworzyć podwójną nić z odpowiednią komplementarną nicią DNA lub RNA.

Żyłkowanie DNA: Ta strona omawia proces wyżarzania dla wszystkich oligonukleotydów. Czasami wyżarzanie jest określane jako wyżarzanie DNA, mimo że proces ten jest również stosowany w przypadku RNA. Wyżarzanie to proces ogrzewania i chłodzenia dwóch jednoniciowych oligonukleotydów o komplementarnych sekwencjach. Ciepło przerywa wszystkie wiązania wodorowe, a chłodzenie umożliwia tworzenie nowych wiązań między sekwencjami.

Sprzęt i materiały do wyżarzania DNA / RNA

• Blok cieplny lub termocykler
• 2 ml probówki wirówkowe
• .Końcówki do pipet
• Milli-Q^® H₂O
• EDTA (Product No. E9884)
• NaCl (Nr produktu. S3014)
• Trizma^® base (Product No.93362)
• Dwa jednoniciowe oligonukleotydy o komplementarnych sekwencjach

Metoda wyżarzania DNA / RNA

Proces wyżarzania dzieli się na dwa główne etapy: 1) rozpuszczanie i 2) wyżarzanie za pomocą bloku cieplnego lub termocyklera.

Rozpuszczanie oligonukleotydów

Chociaż każdy oligonukleotyd jest dostarczany w odmierzonej ilości, w celu uzyskania najlepszych wyników należy zweryfikować go za pomocą spektrofotometru, aby upewnić się, że do reakcji dodano równe ilości każdego oligonukleotydu.

• Rozpuść każdy oligonukleotyd w pewnej objętości buforu wygrzewającego (patrz przepisy dotyczące buforów poniżej), tak aby każdy z nich miał takie samo stężenie.
• Stężenie każdego oligonukleotydu musi wynosić 2-krotność pożądanego stężenia dupleksu oligonukleotydu.

Przykład

Żądane stężenie dupleksowego oligonukleotydu wynosi 50 µM.

1. Oligonukleotyd 1: dostarczony z 10,55 OD (312.6 µg, 49,9 nmol); zweryfikować zmierzoną ilość OD za pomocą spektrofotometru.
2. Oligonukleotyd 2: dostarczony z 9,04 OD (279,7 µg, 45,9 nmol); zweryfikować zmierzoną ilość OD za pomocą spektrofotometru.
3. Każdy roztwór podstawowy oligonukleotydu musi mieć 2-krotność pożądanego stężenia oligonukleotydu dupleksowego, tj. każdy roztwór podstawowy musi mieć stężenie 100 µM.
   1. Dla oligonukleotydu 1, dodać 49.9 x 10 = 499 µL buforu wygrzewającego, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 100 µM.
   2. Dla oligonukleotydu 2, dodaj 45,9 x 10 = 459 µL buforu wygrzewającego, aby utworzyć roztwór podstawowy o stężeniu 100 µM.

*Obliczenie to jest skrótem, który działa tylko w przypadku tworzenia roztworów o stężeniu 100 µM i jest tutaj używany wyłącznie w celach przykładowych. Aby dowiedzieć się więcej na temat obliczania różnych stężeń oligonukleotydów, zobacz Wytyczne dotyczące obsługi i stabilności.

Oligo Annealing

Heat Block

1. Zmieszaj równe objętości oligonukleotydów w mikrotubie.
2. Inkubować mikrotubę w temperaturze 95°C przez 5 minut.
3. Pozwolić mikrotubie powoli ostygnąć do temperatury pokojowej (<60 min).

Termocykler

Chociaż blok cieplny będzie działał, termocykler pozwala na bardziej spójny proces.

1. Zmieszaj równe objętości oligonukleotydów w probówce PCR.
2. Użyj następującego profilu termicznego:
   1. Podgrzej do 95 °C i utrzymuj temperaturę przez 2 min.
      
   2. Chłodzić do 25 °C przez 45 min.
      
   3. Chłodzić do 4 °C w celu tymczasowego przechowywania.
3. Krótko odwirować probówkę PCR, aby usunąć całą wilgoć z wieczka.

Po wdrożeniu bloku cieplnego lub termocyklera, dupleks oligonukleotydu jest teraz gotowy do użycia lub przechowywania. Aby dowiedzieć się więcej na temat przechowywania oligonukleotydów, zobacz Wytyczne dotyczące obsługi i stabilności.

Przepisy na bufory do wyżarzania DNA

Wszystkie bufory należy przygotować z użyciem wody Milli-Q^® .

Skład buforu wygrzewającego (1X)

• 10 mM Tris, pH 7.5 - 8.0
• 50 mM NaCl
• 1 mM EDTA

Skład buforu ligazowego (1X)

Bufor ten jest zwykle używany z ligazą DNA T4.

• 50 mM Tris-HCl, pH 7.5
• 10 mM MgCl₂
• 1 mM ATP
• 10 mM DTT

Skład buforu kinazy (1X)

Bufor ten jest zwykle używany z kinazą polinukleotydową T4.

• 70 mM Tris-HCl, pH 7,6
• 10 mM MgCl₂
• 5 mM DTT