Rozwiązywanie problemów z amplifikacją PCR i RT-PCR

Wiele typowych problemów związanych z PCR i RT-PCR jest identyfikowanych podczas elektroforezy produktów reakcji w żelu agarozowym. Obejmują one brak oczekiwanego produktu amplifikacji, obecność niespecyficznych produktów, nadmierne rozmazanie i obecność pasma "dimeru startera". Poniżej przedstawiono podsumowanie możliwych przyczyn i rozwiązań tych problemów.

Tabela 7.4. Możliwe przyczyny i rozwiązania problemów z amplifikacją PCR i RT-PCR.

Problem	Możliwa przyczyna	Rozwiązanie
Brak pasm na żelu	Jeśli nie przygotowano kontroli pozytywnej, należy rozważyć przetestowanie odczynników w reakcji kontrolnej z matrycą i starterami, które wcześniej wykazały prawidłowe działanie.
	Niewystarczająca ilość matrycy lub zbyt duża ilość matrycy została dodana	Zmierzyć ilość matrycy wymaganą dla danego systemu.
	Dla DNA: Jakość szablonu była niska lub zawiera inhibitory	Nieczyste DNA może nie amplifikować się prawidłowo. Użyj świeżo przygotowanego DNA lub wyizoluj szablon inną metodą.
	Stężenie startera było zbyt niskie lub niezrównoważone	Upewnij się, że stężenie startera mieści się w zalecanym zakresie i że stężenie obu starterów PCR jest takie samo.
	Wprowadzono nukleazy	Przygotuj nową matrycę. Należy przestrzegać środków ostrożności przed wprowadzeniem nukleaz. Jest to szczególnie ważne, gdy materiałem wyjściowym jest RNA.
	Dla RNA: Szablon jest w buforze zawierającym EDTA	EDTA obecne w roztworze RNA będzie chelatować Mg2+ wymagane do RT-PCR i może prowadzić do nieoptymalnych wyników. Aby to zrekompensować, należy dodać dodatkowy Mg2+ podczas składania reakcji. Szczegółowe informacje znajdują się w instrukcji produktu.
	Odczynniki nie zostały prawidłowo rozmrożone przed użyciem	Przed rozpoczęciem reakcji należy rozmrozić i dokładnie wymieszać wszystkie odczynniki.
	Temperatura wyżarzania starterów była zbyt wysoka	Zmniejsz temperaturę wyżarzania w krokach co 2°C.
	Temperatura denaturacji była nieoptymalna	Spróbuj zwiększyć temperaturę lub czas trwania początkowego etapu denaturacji. Jest to szczególnie przydatne w przypadku szablonów bogatych w GC.
	Czas wydłużania był zbyt krótki	Zwiększ czas wydłużania. Może to być szczególnie ważne w przypadku długich reakcji PCR.
	Termocykler nie miał prawidłowej temperatury	Napraw/skalibruj termocykler lub użyj innego urządzenia.
Dodatkowe, niespecyficzne prążki na żelu	Prymery zhybrydyzowane do drugorzędowego miejsca na matrycy	Zaprojektuj nowe primery, które są mniej specyficzne dla drugorzędowego miejsca. Zwiększ temperaturę annealingu o 2°C do 5°C.
	Zanieczyszczenie DNA zostało wprowadzone do primerów lub buforów	Przeprowadź negatywną reakcję kontrolną (bez matrycy). Przygotuj świeże materiały, jeśli wykryto zanieczyszczenie.
	Dla RNA: Szablon jest zanieczyszczony DNA	Przeprowadź etap DNazy i całkowicie inaktywuj/usuń DNazę. Alternatywnie, przygotuj RNA przy użyciu innej metody.
	Dodano zbyt dużo szablonu	Zmierzyć ilość szablonu dla danego systemu.
	Stężenie starterów było zbyt wysokie	Zmierz ilość starterów dla danego systemu.
	Termocykler nie miał prawidłowej temperatury	Napraw/skalibruj termocykler lub użyj innego urządzenia.
Nadmierne rozmazanie amplifikowanego DNA&	Dodano zbyt dużo szablonu	Zmierz ilość szablonu dla swojego systemu.
	Wykonano zbyt wiele cykli	Zmniejsz liczbę cykli poniżej 35.
	Warunki cyklu termicznego nie były optymalne dla twojego cyklera termicznego	Zoptymalizuj warunki w oparciu o zalecenia producenta.
	Temperatura wyżarzania była zbyt niska	W przypadku korzystania z gotowych kulek może być wymagana ponowna optymalizacja temperatury wyżarzania. Zwiększ temperaturę wyżarzania o 2°C do 5°C.
	Stężenie starterów było zbyt wysokie	Zmierz ilość starterów dla swojego systemu.
	Czas przedłużania był zbyt długi	Zmniejszaj czas przedłużania w małych krokach.
	Dla DNA: Jakość szablonu była niska	Nieczyste DNA może nie amplifikować się prawidłowo. Użyj świeżo przygotowanego DNA lub wyizoluj szablon inną metodą.
	Za dużo DNA zostało załadowane na żel	Przeprowadź ponownie z mniejszą ilością próbki.
Dimery primerowe widoczne	Dodano zbyt dużo startera/stężenie startera zbyt wysokie	Zmierz ilość starterów dla swojego systemu.
	Prymery posiadają komplementarną nakładającą się sekwencję	Zaprojektuj primery tak, aby uniknąć samouzupełniających się sekwencji wewnętrznych. Zwiększ temperaturę wyżarzania. Użyj produktów Illustra™ Hot Start Mix PCR.