Niestandardowe startery LAMP we współpracy z New England Biolabs

• Lamp Primer Design
• Quality Assurance
• Cele SARS-CoV-2
• Referencje

W połączeniu z detekcją w czasie rzeczywistym, LAMP (loop-mediated isothermal amplification) jest popularną technologią amplifikacji izotermicznej stosowaną do tworzenia diagnostyki molekularnej COVID-19 . Dzieje się tak między innymi dlatego, że LAMP, a konkretnie RT-LAMP (odwrotna transkrypcja LAMP) w przypadku SARS-CoV-2, jest niezawodną metodą specyficznego wykrywania kwasów nukleinowych.

Chociaż metody te są niezawodne, nadal najlepiej jest zoptymalizować reakcję, a także jej składniki. Jest to szczególnie prawdziwe, biorąc pod uwagę, że LAMP jest dobrze znany z wytwarzania fałszywych amplikonów, które mogą prowadzić do fałszywie dodatnich wyników¹. Podczas gdy optymalizacja reakcji należy do twórcy testu, dostawcy muszą przewodzić w optymalizacji komponentów.

Polimeraza wypierająca nić, np. Bst Polimeraza DNA, która katalizuje reakcję LAMP, jest ważnym składnikiem, który ma właściwości podlegające bezpośredniej poprawie, np. poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce². Szybkim i pośrednim sposobem "ulepszenia polimerazy" jest ulepszenie innego równie ważnego składnika, starterów. Najlepszym sposobem na to jest dopracowanie metod oczyszczania stosowanych w procesie produkcyjnym (rysunek 1). Oczyszczanie oligonukleotydów LAMP metodą Desalt lub HPLC jest powszechne i często możliwe jest zmodyfikowanie obu metod w celu stworzenia zoptymalizowanych starterów.

Niestandardowe startery LAMP, pochodna naszych iScale Oligos™, mają na celu zmaksymalizowanie funkcji starterów LAMP w testach, które mają być wykorzystywane jako narzędzia badawcze w naukach przyrodniczych, diagnostyce molekularnej i testach laboratoryjnych.

Rysunek 1. Ogólny przegląd głównych etapów procesu produkcji niestandardowych primerów LAMP (dla uproszczenia pominięto etapy poprzedzające syntezę i następujące po oczyszczaniu).

LAMP Primer Design

Aby zapoznać się z podstawowymi informacjami na temat projektowania niestandardowych primerów LAMP, a także uzyskać dostęp do bezpłatnego narzędzia do projektowania, zapoznaj się z doskonałymi zasobami dostępnymi w New England Biolabs.
 

Zalety produktu

• Ilości dostępne w celu zaspokojenia potrzeb od badań i rozwoju do komercjalizacji
• Konsultacje z naszym zespołem naukowym w celu ustalenia ostatecznych specyfikacji
• Specjalistyczne oczyszczanie, zapewniające wysoką wydajność starterów

Cechy produktu

W przypadku pytań oznaczonych poniżej jako "Zapytaj" lub jeśli masz potrzeby, które różnią się od innych przedstawionych ogólnych specyfikacji, wyślij zapytanie na adres  dnaoligos@sial.com.

Specyfikacje niestandardowych starterów LAMP

*Zalecamy co najmniej oczyszczenie starterów FIP/BIP za pomocą HPLC.

Ilości	- 10 mg do 2 g (zapytaj o większe ilości)
Oczyszczanie*	- Desalt (undefined) & HPLC (≥85%)
Długości sekwencji	- 10 do 50 baz (w przypadku dłuższych sekwencji prosimy o zapytanie)
Modyfikacje	-Zapytanie o wykonalność modyfikacji
Kontrola jakości	- 100% spektrometria mas - Dostępna analityczna HPLC - Dostępny certyfikat analizy<
Format	- Dostarczany w postaci suchej lub roztworu w probówkach (zapytaj o możliwość innych formatów)

Zapewnienie jakości

Podstawą naszych procesów produkcyjnych jest solidny System Zarządzania Jakością (QMS), który zapewnia zgodność z następującymi rejestracje jakości:

• ISO 9001:2015 dla produkcji oligonukleotydów klasy badawczej
• ISO 13485:2016 dla produkcji oligonukleotydów klasy diagnostycznej
• ISO 14001:2015 za skuteczne zarządzanie środowiskiem

SARS-CoV-2 LAMP Primers

.Oprócz tego, że jest to solidna metoda, jak opisano powyżej, kolorymetryczna RT-LAMP szybko zyskuje na popularności jako diagnostyka molekularna, szczególnie w przypadku SARS-CoV-2, ponieważ pozwala na szybkie wykrywanie przy minimalnym oprzyrządowaniu. Obecnie kilka testów EUA (Emergency Use Authorization) wykorzystuje startery z Tabeli 1, które są opisane w Ulepszenie szybkości i czułości kolorymetrycznej amplifikacji izotermicznej za pomocą pętli z chlorkiem guanidyny³. Bezpośrednie testy przeprowadzone przez kilku użytkowników końcowych wykazały, że nasze niestandardowe startery LAMP doprowadziły do wyjątkowej wydajności z zestawami starterów E1, N2 i As1e.

Cele SARS-CoV-2

Zestaw sekwencji E1
Nazwa oligo	Sekwencja	Typowy stosunek primerów*	Zalecane oczyszczanie
E1-F3	TGAGTACGAACTTATGTACTCAT	1X	Desalt
E1-B3	TTCAGATTTTAACACGAGAGT	1X	Desalt
E1-FIP	ACCACGAAAGCAAGAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG	8-10X	HPLC
E1-BIP	TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT	8-10X	HPLC
E1-LF	CGCTATTAACTATTAACG	2X	Desalt
E1-LB	GCGCTTCGATTGTGCGT	2X	Desalt

Zestaw sekwencji N2
Nazwa oligo	Sekwencja	Typowe proporcje starterów*	Zalecane oczyszczanie
N2-F3	ACCAGGAACTAATCAGACAAG	1X	Desalt
N2-B3	GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT	1X	Desalt
N2-FIP	TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC	8-10X	HPLC
N2-BIP	CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA	8-10X	HPLC
N2-LF	GGGGCAAATTGTGCAATTTG	2X	Desalt
N2-LB	CTTCGGAACGTGTTGACC	2X	Desalt

Tabela 1. Zestawy starterów E1, N2 i As1e stosowane obecnie w kilku testach EUA wykrywających SARS-CoV-2. Uwzględniono typowe proporcje starterów i zalecane oczyszczanie.

Zestaw sekwencji As1e
Nazwa oligo	Sekwencja	Typowe proporcje primerów*	Zalecane oczyszczanie
As1e-F3	CGGTGACAAATTGTCAC	1X	Desalt
As1e-B3	CTTCTCTGGATTTAACACACTT	1X	Desalt
As1e-FIP	TCAGCACAAAGCCAAAATTTATTTTCTGTGCAAAGGAAATTAAGGAG	8-10X	HPLC
As1e-BIP	TATTGGTGGAGCTAAACTTAAAGCCTTTTCTGTACAATCCCTTGAGTG	8-10X	HPLC
As1e-LF	TTACAAGCTTAAAGAATGTCTGAACACT	2X	Desalt
As1e-LB	TTGAATTTAGGTGAAACATTTGTCACG	2X	Desalt

*Typowe proporcje starterów oznaczają, że FIP/BIP muszą być obecne na poziomie 8-10 razy wyższym niż F3/B3, a LF/BF muszą być obecne na poziomie 2 razy wyższym, aby chemia LAMP działała prawidłowo.

Referencje

1. Jiang YS, Bhadra S, Li B, Wu YR, Milligan JN, Ellington AD. 2015. Robust Strand Exchange Reactions for the Sequence-Specific, Real-Time Detection of Nucleic Acid Amplicons. Anal. Chem.. 87(6):3314-3320. https://doi.org/10.1021/ac504387c

2. Maranhao A, Bhadra S, Paik I, Walker D, Ellington AD. An improved and readily available version of Bst DNA Polymerase for LAMP, and applications to COVID-19 diagnostics. https://doi.org/10.1101/2020.10.02.20203356

3. Zhang Y, Ren G, Buss J, Barry AJ, Patton GC, Tanner NA. 2020. Enhancing colorimetric loop-mediated isothermal amplification speed and sensitivity with guanidine chloride. BioTechniques. 69(3):178-185. https://doi.org/10.2144/btn-2020-0078

4. Huang X, Tang G, Ismail N, Wang X. 2022. Developing RT-LAMP assays for rapid diagnosis of SARS-CoV-2 in saliva. eBioMedicine. 75103736. https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2021.103736

Aby uzyskać pomoc techniczną, prosimy o kontakt z naszą  grupą usług technicznych.