Optymalizacja i walidacja testów PCR

Przewodnik techniczny po technologiach PCR

Na tej stronie

• Optymalizacja warunków PCR
  
• Validating Primer Design
• Optimizing Probe Concentration
• .Optymalizacja składników reakcji i testów multipleksowych
• Optymalizacja stężenia Mg2+ 
• Wybór fluoroforu sondy i wygaszacza
• Wytyczne dotyczące optymalizacji ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)
• Ocena testu

Optymalizacja warunków PCR

Optymalizacja i walidacja testu są niezbędne, nawet w przypadku korzystania z testów, które zostały wcześniej zaprojektowane i uzyskane komercyjnie. Optymalizacja jest wymagana, aby zapewnić, że test jest tak czuły, jak jest to wymagane i że jest specyficzny dla celu zainteresowania. Na przykład wykrywanie patogenów lub profilowanie ekspresji rzadkich mRNA wymaga wysokiej czułości; wykrywanie SNP wymaga wysokiej specyficzności, a kwantyfikacja wirusów wymaga zarówno wysokiej specyficzności, jak i czułości. Testy wymagające wysokiej specyficzności są szczególnie wrażliwe, gdy są wykonywane bez optymalizacji i odpowiednich kontroli. Podobnie, gdy wiele celów ma być wykrywanych jednocześnie w reakcjach multipleksowych, warunki testu muszą być zoptymalizowane, aby wykryć wszystkie cele w równym stopniu. Walidacja dostarcza danych wymaganych do uzasadnienia dalszego stosowania testu w dalszych projektach badawczych¹.

Istnieje szereg czynników, które można zmienić, aby uzyskać optymalną wydajność testu, a tym samym prowadzić do wyższej czułości molekularnej, swoistości i precyzji. Testy zakupione od wykwalifikowanych dostawców komercyjnych nadal wymagają walidacji w laboratorium, w którym są używane. Oświadczenia dotyczące wydajności testów powinny być weryfikowane w warunkach badania, w tym próbek testowych, określonych odczynników i wybranego instrumentu.

Test, który został zaprojektowany w taki sposób, że wszystkie pożądane kryteria projektowe zostały spełnione (PCR/qPCR/dPCR Assay Design) prawdopodobnie będzie działać dobrze w szerokim zakresie warunków. Jednak wszystkie testy mają zestaw optymalnych warunków, które zależą od urządzenia, wybranych odczynników (warunki buforowe), stężenia starterów i/lub temperatury annealingu (T_a), stężenia magnezu, a nawet szybkości rampy. Ponieważ zwykle przeprowadza się test na wybranym urządzeniu i w standardowych warunkach buforowych, większość procedur optymalizacji koncentruje się na modyfikacji kinetyki wiązania starterów przy użyciu stężenia starterów lub temperatury wyżarzania (T_a)/temperatury topnienia (T_m).

Niezależnie od tego, czy celem jest DNA (qPCR) czy RNA (RT-qPCR), następujące kroki wstępne pomogą zapewnić pomyślną kwantyfikację:

• Validating Primer Design
  
• Optimizing Primer Concentrations
  
• Optimizing Primer Annealing Temperature
• Optymalizacja stężenia sondy
  
• Optymalizacja składników reakcji i warunków multipleksowania
  
• Weryfikacja wydajności za pomocą krzywej standardowej i analizy krzywej topnienia

Walidacja projektu startera

Walidacja projektu startera jest szczególnie ważna w przypadku przyjmowania starterów z poprzedniej publikacji lub przy użyciu testu dostarczonego komercyjnie. Projekt primera można zweryfikować w odniesieniu do wskazówek dotyczących projektowania testu zawartych w PCR/qPCR/dPCR Assay Design. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że:

• Prymery są homologiczne do pożądanej sekwencji docelowej.
  
• Prymer odwrotnego dopełnienia jest prawidłowy. Dokładnie sprawdź kolejność zasad dopełnienia odwrotnego (używając http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html).
  
• Wykrywane są odpowiednie warianty splicingu.
  
• Unikano SNP, chyba że jest to wymagane dla testu.
  
• Oligo i amplikon nie przyjmują struktury drugorzędowej.
  
• Istnieje niski potencjał hybrydyzacji oligos w reakcji.

Dimery starterów

Zdolność starterów do hybrydyzacji ze sobą, zwłaszcza na 3'-końcu, może prowadzić do wydłużenia starterów podczas PCR i tworzenia produktów niezależnych od celu, znanych jako dimery starterów. Ilekroć produkty dimerów primerów są wytwarzane i amplifikowane, odwracają one składniki reakcji od syntezy pożądanego produktu, zmniejszając w ten sposób wydajność i czułość testu. Dlatego dimery starterów są problemem w reakcjach wykorzystujących zarówno detekcję opartą na sondzie, jak i barwniku SYBR Green I. W przypadku wykrywania opartego na barwnikach, takich jak SYBR Green I, dimery starterów również wpływają na specyficzność testu, ponieważ niespecyficzny barwnik wiążący DNA będzie wiązał się ze starterami i będzie wykrywany wraz z pożądanym produktem. Dlatego należy unikać starterów, które mogą tworzyć dimery starterów.

Przewidywanie dimerów starterów

Aby określić potencjał tworzenia dimerów starterów, należy użyć oprogramowania do projektowania starterów do analizy tworzenia dupleksów.Oprogramowanie  OligoArchitect zapewnia szczegółowe informacje na temat siły hybrydyzacji samodimeru i dimeru krzyżowego (Rysunek 9.1). Wszelkie 3'-końcowe dimery utworzone przez starter hybrydyzujący z samym sobą lub ze swoim partnerem muszą być bardzo słabe (ΔG ≥ -2,0 kcal, Rysunek 9.1).

Jak można zredukować dimer startera?

Należy unikać starterów z terminalnym ΔG < -2,0 kcal i wydłużalnym 3'-końcem (5'-overlap). Najsilniejszy ogólny dimer powinien być niestabilny (ΔG ≥ -6,0 kcal). Aby uniknąć silnych 3'-końcowych dimerów przy zachowaniu specyficzności, wybierz startery, które mają 2 reszty G lub C w ostatnich 5 zasadach, 1 G lub C w ostatnich 3 zasadach i A lub T na 3'-końcu (Rysunek 9.1).

Rysunek 9.1. Analiza starterów pod kątem potencjału primer-dimer. Sekwencje starterów zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania OligoArchitect w celu określenia ich zdolności do tworzenia dupleksów. Potencjał samodimerów i dimerów krzyżowych jest pokazany dla najlepszej opcji primera. Multiplex qPCR da najlepsze wyniki, jeśli wszystkie startery w reakcji mają podobne temperatury topnienia (różnica Tm ≤ 2 °C) i nie tworzą silnych 3'-dupleksów (ΔG ≥ -2,0 kcal).

Optymalizacja stężeń starterów i temperatury wyżarzania (T_a)

Podczas optymalizacji warunków testu przy użyciu stężenia starterów, wybierana jest stała T_a  (zwykle 60 °C), a optymalne warunki dla każdego startera są rozpatrywane niezależnie. Ma to krytyczne znaczenie przy projektowaniu testu do przeprowadzenia w multipleksie, ponieważ wszystkie reakcje muszą przebiegać w tej samej temperaturze wyżarzania i jest to taktyka, która może być również wykorzystywana do ratowania słabo działających testów, dla których alternatywny projekt jest niedostępny. Technicznie prostszym podejściem jest wybór stałego stężenia starterów, a następnie optymalizacja T_a wybór najlepszego wyniku dla tych starterów w połączeniu. Jest to preferowane podejście w przypadku korzystania z kilku testów i wykrywania barwnika wiążącego dsDNA, takiego jak SYBR^® Green I. Podejście to wymaga jednak urządzenia, które może jednocześnie uruchamiać programy reakcji wykorzystujące różne opcje T_a .

Optymalizacja stężeń starterów

W przypadku stosowania qPCR opartego na sondach, zadowalające wyniki często uzyskuje się przy użyciu końcowych stężeń obu starterów na poziomie 500 nM i sondy na poziomie 250 nM, zwłaszcza jeśli cel PCR jest obfity i nie jest wymagana maksymalna czułość. Nieco niższe stężenia starterów, między 200 nM a 400 nM, są zazwyczaj lepsze w przypadku stosowania wykrywania opartego na barwniku SYBR Green I w celu zminimalizowania niespecyficznej amplifikacji i optymalizacji reakcji multipleksowych. Aby sprawdzić, czy standardowe warunki są odpowiednie do użycia, należy przeprowadzić analizę krzywej standardowej (patrz  Assay Evaluation). Jeśli wykrywanie jest liniowe, powtarzalne, a gradient wynosi od -3,2 do -3,5 w zakresie stężeń docelowych oczekiwanych w próbkach, dalsza optymalizacja stężeń starterów i sond może nie być konieczna.

Niektóre z oznak, że test nie jest dobrze zoptymalizowany, to brak powtarzalności między powtórzeniami oraz ogólna nieefektywność i niewrażliwość. Wydajność testu jest zwykle testowana w zakresie stężeń starterów, na przykład od 50-800 nM, przy użyciu każdego startera w każdym stężeniu (Rysunek 9.2; pełny protokół znajduje się w Appendix A, Protocols; Primer Optimization).

Rysunek 9.2. Przykład optymalizacji starterów. Układ pasków z 8 probówkami (u góry i po lewej stronie) oraz płytka PCR do rozcieńczania i dozowania primerów.

Wybierana jest kombinacja stężeń dających najniższe C_q, najniższą zmienność w replikach i ujemny NTC (Rysunek 9.3)².

Rysunek 9.3. Wyniki optymalizacji stężenia starterów PCR w teście z barwnikiem SYBR Green I. A) Ustalone wytyczne zalecają przetestowanie różnych stężeń starterów do przodu (F) i do tyłu (R). W tym przykładzie przetestowano kombinację 50 nM do 600 nM w celu określenia optymalnego stężenia dla testu. W tym eksperymencie istnieje ogromna różnica w Cq ze względu na różne stężenia starterów, co ilustruje, jak może to wpłynąć na ostateczne dane (dane od Jens Stolte, EMBL). B) Ten eksperyment pokazuje optymalizację dobrze zaprojektowanego testu i zmienność wynikającą ze stężenia starterów. Kombinacja starterów 400 nM do przodu i do tyłu została wybrana jako optymalna, ponieważ ta kombinacja reprezentowała najniższe stężenia starterów, które w powtarzalny sposób dawały najwcześniejsze wartości Cq przy zachowaniu krzywej sigmoidalnej.

Jeśli jeden cel w reakcji multipleksowej jest znacznie bardziej obfity niż inne lub jeśli jedna para starterów daje znacznie niższe C_q niż inne, amplifikacja tego celu może zdominować reakcję, zużywając składniki reakcji, zanim inne cele będą wykrywalne. Dostosowanie stężeń starterów może pozwolić na bardziej zrównoważoną amplifikację wszystkich celów. Aby określić, czy takie dostosowania będą korzystne, należy przygotować krzywe standardowe (patrz  Ocena testu), które obejmują zakres celów oczekiwanych dla każdej pary starterów samodzielnie (singleplex) i ze wszystkimi starterami łącznie (multiplex). Jeśli reakcje multiplex i singleplex dają podobne wyniki, stężenia starterów są odpowiednie. Z drugiej strony, optymalizacja stężeń starterów prawdopodobnie poprawi wyniki, jeśli czułość jest niedopuszczalna w reakcjach multipleksowych. Zmniejsz stężenia starterów dla tych par starterów, które dają niskie wartości C_q i/lub zwiększ stężenia dla tych, które dają wysokie wartości C_q w zakresie 50-500 nM.

Optymalizacja temperatury wygrzewania starterów

Kwantytatywne testy PCR są zazwyczaj przeprowadzane przy użyciu dwu- lub trzyetapowych programów cykli temperaturowych, zazwyczaj z 35-40 cyklami. Reakcje dwuetapowe przechodzą między dwiema temperaturami, zwykle 95°C (zwykle przez 10-15 sekund) i 60°C (zwykle przez 30-60 sekund lub 5-10 sekund w szybkich warunkach). Dwuetapowe reakcje temperaturowe są wybierane podczas przeprowadzania testów z podwójnie znakowaną sondą (TaqMan lub hydroliza), ponieważ wydłużanie w niższej temperaturze promuje aktywność egzonukleazy polimerazy DNA i zniechęca do przemieszczania sondy. Byłby to preferowany protokół warunków cyklicznych do wykonywania wielu różnych testów przy tych samych parametrach. Jednak wadą stosowania metody dwuetapowej jest to, że zmniejsza ona potencjalne opcje projektowania starterów i ogranicza optymalizację testu do samego stężenia starterów, ponieważ nie jest możliwa optymalizacja temperatury annealingu (T_a).

Trzyetapowy protokół cyklu jest preferowany, gdy sekwencje docelowe są złożone i albo wybrane startery są trudne do optymalizacji, albo używany system wykrywania nie zależy od użycia sondy hydrolizy. Strategie trzystopniowe obejmują cykle pomiędzy: 95 °C (zwykle przez 10 s), temperaturą annealingu (między 55 °C a 65 °C, zwykle przez 10-20 s lub 5 s w szybkich warunkach) i 72 °C (zwykle przez 20-30 s lub 15-20 s w szybkich warunkach). W tym przypadku, T_a może być zoptymalizowana w celu dalszej poprawy wydajności testu przy użyciu następującego protokołu:

• Zacznij od dolnego końca zakresu T_a do przetestowania, który jest określony przez T_a starterów, i stopniowo zwiększaj temperaturę w stopniowych przyrostach (zwykle testowanie między 55 °C a 65 °C). Niektóre urządzenia mają bloki gradientowe, które ułatwiają optymalizację temperatury w jednym przebiegu.
  
• Sprawdź każdy produkt reakcji pod kątem specyficzności, albo poprzez analizę krzywej topnienia po PCR, albo elektroforezę w żelu agarozowym, jak opisano poniżej.
  
• Optymalna temperatura wyżarzania to taka, która skutkuje najniższym C_q, ujemnym NTC, analizą krzywej topnienia ujawniającą wykrycie specyficznego produktu i wysoką powtarzalnością między reakcjami replikacji.

Jeśli temperatura wyżarzania jest zbyt niska, reakcja będzie niespecyficzna. Jeśli jednak temperatura jest zbyt wysoka, surowość może wpływać na wydajność reakcji, powodując brak amplifikacji lub bardzo wysokie wartości C_q bardzo słabe wydajności i niską odtwarzalność.

Przykład optymalizacji temperatury pokazano na Rysunku 9.4. W tym przypadku (Rysunek 9.4A) identyczne reakcje przeprowadzono na gradientowym bloku PCR, tak aby temperatura wyżarzania wynosiła od 47,8 °C do 71,7 °C. Wyżarzanie w 64,8 °C i 61,7 °C skutkuje identycznymi wartościami C_q ale nieco niższa temperatura daje wyższą wydajność produktu, o czym świadczy wyższa fluorescencja punktu końcowego i reakcja z pozornie wyższą wydajnością (wskazaną przez gradient wykresu amplifikacji). Bezwzględne określenie wydajności wymaga oceny krzywej standardowej (patrz Ocena testu) lub zastosowania algorytmów określania wydajności pojedynczej probówki^3,4. Druga część rysunku (Rys. 9.4B) przedstawia porównanie zachowania starterów w identycznych warunkach reakcji, ale w różnych mieszaninach odczynników. W tym przypadku jasne jest, że skład buforu wpływa na odtwarzalność testu i zakres temperatur, w których uzyskuje się stabilne dane. Na koniec zaprojektowano dwa niezależne testy dla tego samego genu docelowego i zoptymalizowano je w każdym buforze. Jak pokazano na Rysunku 9.4C, każdy bufor wymagał innej optymalnej temperatury, aby uzyskać porównywalne dane C_q z dwóch par starterów (61,7 °C w LuminoCt i 58,4 °C w KiCqStart).

Rysunek 9.4. Optymalizacja starterów przy użyciu Ta. A) Przetestowano zakres temperatur wyżarzania dla identycznych reakcji. Wyżarzanie w 64,8 °C i 61,7 °C daje identyczne wartości Cq i wysoką powtarzalność między powtórzeniami, ale nieco niższa temperatura daje wyższą wydajność produktu. B) Przeprowadzono dwie identyczne reakcje z użyciem różnych mieszanin odczynników (LuminoCt® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ lub KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™) i gradientu temperatury starterów. Optymalna temperatura różniła się w każdej mieszaninie i występowały mniejsze różnice między danymi, gdy reakcje były prowadzone w odczynnikach KiCqStart. C) Dwie pary starterów do tego samego celu (KS i zaprojektowane przy użyciu Beacon Designer, BD) zostały uruchomione w różnych mieszaninach reakcyjnych. Można zauważyć, że optymalna temperatura wyżarzania jest różna w różnych odczynnikach (61,7 °C w LuminoCt i 58,4 °C w KiCqStart), aby uzyskać podobne wyniki z primerów.

Chociaż większość komercyjnych testów jest dostarczana ze standardowymi warunkami testu PCR, poszczególne testy mogą skorzystać z dalszej optymalizacji w celu zidentyfikowania warunków specyficznych dla określonej kombinacji starterów. Może to być spowodowane dimerami starterów, niespecyficzną amplifikacją lub nieoptymalną wydajnością reakcji w wybranych warunkach domyślnych. Po zakończeniu optymalizacji należy obliczyć wydajność testu, stosując wybrane warunki do pomiaru serii wzorców i przygotowując krzywą standardową (Assay Evaluation). Możliwe jest, że nawet po optymalizacji wydajność może być nadal nieoptymalna, aw najgorszym przypadku może być wymagane nowe badanie.

Zakres dopuszczalnych wartości wydajności powinien zostać zdefiniowany przez użytkownika przed rozpoczęciem procesu optymalizacji. Idealnie, wydajność powinna wynosić 95%. Możliwe jest jednak wykonywanie dokładnych pomiarów za pomocą testów, których wydajność wynosi 90% i, podobnie jak w przypadku projektowania starterów, sekwencja docelowa może dyktować, że cel nie może być amplifikowany z wyższą wydajnością. Niemniej jednak, w przypadku stosowania testu o niższej wydajności, prawdopodobne jest, że wpłynie to na precyzję i granicę wykrywalności. W takich okolicznościach istotne jest zachowanie odpowiedniej dyskrecji podczas interpretacji i raportowania danych¹.

Optimizing Probe Concentration

Końcowe stężenie sondy 250 nM może być stosowane w większości testów. Jednakże, jeśli maksymalna czułość nie jest wymagana, niższe stężenia sondy mogą być wystarczające, zmniejszając w ten sposób koszt testu. Aby zoptymalizować warunki sondy, należy przetestować ją w kilku stężeniach, w zakresie od 50 do 500 nM, w połączeniu ze zoptymalizowanymi stężeniami starterów i najniższym stężeniem docelowego kwasu nukleinowego, które ma zostać uwzględnione w końcowych eksperymentach. Można zastosować najniższe stężenie sondy, które umożliwia najbardziej czułe wykrywanie (C_q ≤ 30 z najlepszą odtwarzalnością).

Optymalizacja składników reakcji i testów multipleksowych

Niektóre testy są szczególnie wrażliwe na warunki buforu/reakcji. W przypadku tych testów dalsza modyfikacja buforów reakcyjnych poprzez optymalizację stężenia MgCl₂ dodanie wzmacniaczy PCR (Mueller in PCR Technologies; Current Innovations, 2013⁵) lub dostosowanie szybkości rampy urządzenia może skutkować poprawą wydajności. Oprócz wytycznych dotyczących optymalizacji testów przedstawionych w poprzednich sekcjach, czynniki te są szczególnie ważne podczas optymalizacji reakcji multipleksowych.

Optymalizacja stężenia Mg²⁺ 

Magnez odgrywa kilka ról w PCR. Jest wymaganym dwuwartościowym przeciwjonem kationowym dla dNTP i kofaktorem dla wszystkich polimeraz. Kationy dwuwartościowe silnie wpływają na hybrydyzację podwójnej nici DNA. Zwiększenie stężenia magnezu podnosi stabilność lub temperaturę topnienia dupleksu DNA. Wynika z tego, że wysokie poziomy magnezu zwiększają powinowactwo primerów do hybrydyzacji, w tym zdarzeń błędnego primerowania i interakcji primer-primer. Nieprawidłowo naprymowane dupleksy DNA stają się substratami dla polimerazy DNA, w efekcie tworząc produkty uboczne i obniżając wydajność PCR. Dlatego stężenie MgCl₂ ma wpływ zarówno na specyficzność, jak i wydajność PCR, ponieważ magnez wpływa na hybrydyzację startera do celu, procesywność polimerazy Taq DNA, a także szybkość hydrolizy przez cząsteczkę egzonukleazy, gdy jest stosowana do rozszczepiania sondy w qPCR. W związku z tym niewystarczająca ilość MgCl₂ skutkuje niską wydajnością z powodu niskiej szybkości polimeryzacji polimerazy DNA, pogorszonego wiązania starterów i nieefektywnego rozszczepiania sondy. Jeśli stężenie MgCl₂ jest zbyt wysokie, specyficzność reakcji będzie zagrożona, ponieważ doprowadzi to do większej stabilności niespecyficznej hybrydyzacji starterów.

W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów PCR, które wykorzystują 1,5-2 mM standardowego MgCl₂ stężenia, testy qPCR z sondą hydrolizującą wymagają wyższych stężeń około 3-5 mM, aby osiągnąć skuteczne rozszczepienie sondy. Obecność MgCl₂ zwiększa również szybkość hybrydyzacji DNA, umożliwiając wydajną hybrydyzację podczas szybkich cykli stosowanych w wielu urządzeniach. Optymalizacja stężenia MgCl₂ staje się ważniejsza podczas prowadzenia reakcji multipleksowych.

Sole, takie jak KCl lub (NH₄)₂SO_4,.również zmieniają T_m, dupleksu DNA, ale efekt jest mniej drastyczny dla tych jednowartościowych kationów.

Rysunek 9.5. Wpływ stężenia magnezu.

Efekty, przedstawione na Rysunku 9.5, są powiększone podczas wykonywania multipleksowej reakcji PCR. Prowadzenie wielu reakcji jednocześnie wprowadza konkurencję o odczynniki i pogarsza wszelkie nieoptymalne warunki, powodując poważne zmiany w wydajności PCR.

Ramp Rates

W rzadkich przypadkach trudna reakcja wymaga dalszych modyfikacji. Gdy wszystkie inne opcje zostały wyczerpane, może być możliwe odzyskanie utraconej sytuacji poprzez empiryczne testowanie i modyfikację szybkości rampy PCR.

Wybór fluoroforu sondy i wygaszacza

Podczas wykonywania testów multipleksowych ważne jest również zmaksymalizowanie separacji widmowej wielu emisji z różnych fluoroforów w celu ułatwienia izolacji sygnału i analizy danych. Dlatego fluorofory o wąskich, dobrze rozdzielonych szerokościach pasma, które są szeroko rozdzielone, są przydatne w zastosowaniach multipleksowych. Jednak w rzeczywistości wybór fluoroforu jest ograniczony przez system optyczny urządzenia. Ilościowa PCR i cyfrowe metody wykrywania PCR zawiera dalsze informacje dotyczące wyboru fluoroforów i wygaszaczy.

Wytyczne dotyczące optymalizacji ilościowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR)

.Podczas wykonywania RT-qPCR ważne jest nie tylko uwzględnienie wytycznych dotyczących standardowego qPCR, jak omówiono wcześniej, i optymalizacja RT, jak omówiono w Odwrotna transkrypcja, ale także odniesienie się do następujących punktów, które są specyficzne dla etapu RT:

• Weryfikacja jakości RNA (oczyszczanie próbki i ocena jakości).
  
• Potwierdź, że startery obejmują lub otaczają długie introny (PCR/qPCR/dPCR Assay Design).
  
• Optimize Reverse Transcription (odwrotna transkrypcja).
  
• Weryfikuj dane kontrolne bez odwrotnej transkryptazy (No-RT).

Potwierdź, że startery obejmują lub flankują długie introny

Podczas gdy większość gDNA jest eliminowana z próbki podczas oczyszczania RNA, żadna procedura nie usuwa całego DNA. Ponieważ PCR jest w stanie amplifikować pojedynczą cząsteczkę DNA, zanieczyszczające DNA jest amplifikowane tak samo jak RNA podczas stosowania RT-qPCR. Jeśli docelowe mRNA jest dość obfite (setki lub tysiące kopii na komórkę), wynikowy sygnał z zanieczyszczającej amplifikacji DNA będzie nieistotny w porównaniu z produktami z RNA; jeśli jednak docelowe mRNA jest umiarkowanie obfite lub rzadkie (<100 kopii/komórkę), sygnał wynikający z amplifikacji DNA może prowadzić do błędnie wysokich szacunków poziomów mRNA. Aby uniknąć amplifikacji DNA podczas RT-qPCR, tam gdzie to możliwe, należy używać starterów, które albo otaczają intron, który nie występuje w sekwencji mRNA, albo obejmują połączenie ekson-ekson (PCR/qPCR/dPCR Assay Design).

Jeśli gen będący przedmiotem zainteresowania nie zawiera intronów, jeśli pozycje intronów są nieznane lub jeśli nie ma odpowiednich starterów, które obejmują lub flankują introny, może być konieczne trawienie wejściowego RNA za pomocą DNazy I wolnej od RNazy lub o stopniu amplifikacji. Dane z kontroli bez RT można wykorzystać do określenia, czy konieczne jest dalsze trawienie DNazą I.

Weryfikacja danych kontrolnych bez odwrotnej transkryptazy (bez RT)

Niezależnie od tego, czy startery obejmują lub flankują introny, specyficzność testów RT-qPCR powinna być testowana w reakcjach kontrolnych, które nie zawierają odwrotnej transkryptazy (kontrola bez RT) w celu oceny potencjalnej amplifikacji z zanieczyszczającego DNA. Jak opisano w PCR/qPCR/dPCR Assay Design, sekwencje DNA z krótkimi intronami (≤1 kb) mogą być z powodzeniem amplifikowane w RT-PCR. Wiele genów ma dodatkowe kopie lub pseudogeny, które nie mają jednego lub więcej intronów. W rezultacie udział DNA w danych wynikowych z testów RT-PCR należy przetestować, wykonując reakcję zawierającą próbkę RNA, ale bez enzymu RT, wraz z reakcjami zawierającymi zarówno RNA, jak i enzym RT (Rysunek 9.6). Amplifikacja DNA jest uważana za akceptowalną w qPCR, jeśli wartości C_q dla reakcji bez RT są co najmniej 5 cykli większe niż dla reakcji z RT6. Jeśli jednak między wartościami C_q dla reakcji z RT i bez RT jest mniej niż 5 cykli, amplifikacja DNA może przyczynić się do kwantyfikacji mRNA.

Rysunek 9.6. Ocena kontroli bez RT. Produkty RT-PCR wytworzone w obecności (+) lub nieobecności (-) enzymu RT frakcjonowano na zabarwionym bromkiem etydyny 2% żelu agarozowym w TBE. Primery dla docelowego mRNA w A flankują intron o długości 1 kb. Cel mRNA w B jest zgodny z kilkoma genami, z których co najmniej jeden jest pseudogenem, w którym brakuje intronu między starterami używanymi do RT-PCR, a zatem daje produkt o tej samej wielkości z enzymem RT i bez niego.

Gdy zanieczyszczenie RNA DNA przyczynia się do znaczącego sygnału w eksperymencie, RNA powinno być trawione DNazą I wolną od RNazy lub o stopniu amplifikacji, przed RT-qPCR, aby umożliwić wiarygodną kwantyfikację mRNA. Należy pamiętać, że trawienie DNazą na kolumnie (procedura oferowana z wieloma dostępnymi w handlu zestawami do oczyszczania RNA, w których trawienie DNazą jest wykonywane, gdy RNA jest związany z kolumną krzemionkową) jest mniej skuteczne w eliminowaniu DNA niż trawienie w roztworze po elucji RNA z kolumny. W rezultacie trawienie DNazą na kolumnie (OC) może nie być wystarczające dla RT-qPCR (Rysunek 9.7). Kontrole bez RT powinny być przeprowadzane z RNA trawionym DNazą w celu sprawdzenia, czy trawienie było skuteczne i wystarczające. W przykładzie pokazanym na Rysunku 9.7, trawienie DNazą OC jest wystarczające do wiarygodnego wykrycia docelowego mRNA. Nie wystarczyłoby to do wiarygodnego określenia ilościowego znacznie mniej obfitego mRNA, gdyby wymagana była większa czułość.

Należy pamiętać, że różne typy komórek i tkanek, a także różne warunki wzrostu, wytwarzają znacznie różne stężenia określonych mRNA. Ponadto różne metody oczyszczania RNA dają różne ilości zanieczyszczającego DNA. W rezultacie reakcje z odwrotną transkrypcją i bez niej powinny być wykonywane co najmniej raz z każdym nowym materiałem wyjściowym, metodą przygotowania RNA lub testem.

Rysunek 9.7. Porównanie trawienia DNazą na kolumnie (OC) z trawieniem DNazą po przygotowaniu. Całkowity RNA przygotowano z 30 mg kawałków wątroby myszy za pomocą naszego zestawu GenElute™ Total RNA Kit lub procedury oczyszczania kolumnowego od alternatywnego dostawcy, zgodnie z instrukcjami producenta. Dwie próbki RNA przygotowano z użyciem DNazy na kolumnie odpowiedniego producenta, a dwie przygotowano bez trawienia DNazą. Po oczyszczeniu, podwielokrotności czterech próbek RNA przygotowanych bez DNazy na kolumnie trawiono naszą DNazą I klasy amplifikacji zgodnie z instrukcjami producenta. Równe proporcje wszystkich próbek zostały wykorzystane w jednoetapowym RT-qPCR. Przedstawiono wykresy fluorescencji dla dwóch próbek RNA. Podobne wyniki uzyskano z produktami obu producentów i tylko procedura wymagająca obróbki DNAzy po oczyszczeniu usunęła całe gDNA.

Ocena testu

Po zoptymalizowaniu testu tak, aby zidentyfikować najbardziej czułe warunki, ważne jest określenie specyficzności testu, wydajności i technicznego zakresu dynamicznego.

Określenie specyficzności za pomocą analizy krzywej topnienia

Specyficzność można określić za pomocą analizy krzywej topnienia. Wykonanie krzywej topnienia wymaga włączenia barwnika reporterowego, takiego jak barwnik SYBR Green I lub użycia sondy niehydrolizującej, takiej jak Molecular Beacon lub Scorpions^®. Sonda (patrz Quantitative PCR and Digital PCR Detection Methods). Po wytworzeniu amplikonu podczas qPCR jest on poddawany inkubacji w rosnących temperaturach, zwykle od 55 °C do 95 °C. Użytkownik powinien jednak sprawdzić, czy teoretyczny punkt topnienia jego amplikonu mieści się w tym zakresie, ponieważ będzie on zależał od wielkości i zawartości GC. Eksperymentalna wartość T_m będzie się nieznacznie różnić między różnymi przebiegami i odczynnikami, głównie ze względu na różnice w stężeniu MgCl₂ i innych jonów.

Zmiana fluorescencji jest określana i wykreślana jako szybkość zmiany fluorescencji w funkcji temperatury. Ponieważ SYBR Green I jest niespecyficznym barwnikiem, który wiąże się z dowolnym dwuniciowym DNA, ważne jest, aby sprawdzić, czy qPCR wytwarza tylko pożądany produkt przy użyciu tej chemii wykrywania. Analiza krzywej topnienia lub dysocjacji może być wykorzystana do określenia liczby i przybliżonej wielkości produktów. Test o wysokiej specyficzności spowoduje pojedynczy pik topnienia w wysokiej temperaturze w reakcjach zawierających tylko cel z niczym lub bardzo mało wykrytym w kontrolach bez wzorca (Rysunek 9.8A). Jeśli krzywa topnienia ma więcej niż jeden główny pik, jak na Rysunkach 9.8B i 9.8C, tożsamość produktów może być dalej badana poprzez rozdzielenie ich na żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Jak pokazano na Rysunkach 9.8D i 9.8E, reakcje B i C zawierają nadmierne ilości starterów-dimerów lub innych niespecyficznych produktów. Obniżenie stężenia starterów często zmniejsza ilość niespecyficznych produktów. Jeśli niespecyficzne produkty są nadal wykrywane w znacznych ilościach przy niskich poziomach starterów, najlepiej jest przeprojektować startery.

Rysunek 9.8. Ocena krzywych topnienia. Krzywe topnienia lub dysocjacji pokazujące ostry pik specyficznego produktu w temperaturze >80 °C z bardzo małą ilością niespecyficznego produktu w niższych temperaturach (A) lub znaczne ilości niespecyficznego, niżej topniejącego produktu (B i C). D do F przedstawiają produkty PCR pokazane odpowiednio na krzywych topnienia A do C, rozdzielone na 2% żelach agarozowych zabarwionych bromkiem etydyny.

Przykład analizy krzywej topnienia ujawniającej zanieczyszczenie RNA primerami-dimerami gDNA i NTC przedstawiono na Rysunku 9.9. Na Rysunku 9.9A, specyficzny produkt jest widoczny w reakcjach testowych, a mniejszy produkt, topniejący w niższej temperaturze, jest obecny w NTC. Wskazuje to na tworzenie się primerów-dimerów przy braku matrycy. Jest to zjawisko powszechne i stanowi powód do niepokoju tylko wtedy, gdy te produkty primerów-dimerów są widoczne w badanych próbkach, jak pokazano na Rysunku 9.8. Przykład na Rysunku 9.9B pokazuje wykrywanie nieprzetworzonego genu gDNA w próbce DNA przy użyciu tego samego testu (w tym przypadku startery znajdowały się w eksonach obejmujących intron), który był również używany do wykrywania mRNA. Produkty różnią się profilem topnienia, przy czym produkt gDNA topi się w wyższej temperaturze, ponieważ zawiera również intron.

Rysunek 9.9. Przykład analizy krzywej topnienia A) dimery starterów w kontroli bez matrycy i B) amplifikacja przez intron gDNA.

Specyficzność jest niezwykle ważna przy projektowaniu testów do genotypowania. Są to często testy sond i wymagają rozróżnienia różnicy pojedynczej zasady, na przykład podczas rozróżniania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP). W tym przypadku krytyczne znaczenie ma przetestowanie każdej sondy w pojedynczej reakcji przeciwko szablonowi, o którym wiadomo, że zawiera określoną dopasowaną sekwencję i przeciwko niedopasowanej sekwencji.

Określenie wydajności i granicy wykrywalności

Najskuteczniejszym sposobem pomiaru wydajności testu jest konstrukcja krzywej standardowej z seryjnego rozcieńczenia matrycy. Wydajność testu można zmierzyć jako współczynnik gradientu krzywej standardowej. Szeroki zakres stężeń próbki jest uruchamiany, zapewniając, że osiągają one graniczne rozcieńczenie, umożliwiając w ten sposób określenie technicznego zakresu dynamiki testu z tego samego eksperymentu.

Do tych technicznych oznaczeń wydajności testu odpowiedni jest każdy odpowiedni materiał wzorcowy. Wybór standardowego, przenośnego materiału referencyjnego pozwala na walidację międzylaboratoryjną i wewnątrzlaboratoryjną. Dlatego ten etap walidacji może być przeprowadzony na linearyzowanym lub niklowanym plazmidzie (superzwinięte DNA nie amplifikuje się wydajnie i skutkuje niską odtwarzalnością), sklonowanym fragmencie lub syntetycznym oligo. Należy jednak pamiętać, że walidacja tych celów jest miarą funkcji testu i nie uwzględnia zmienności wprowadzonej przez złożoność próbki biologicznej.

Określenie technicznego zakresu dynamicznego i wydajności testu z krzywej standardowej zilustrowano na Rysunku 9.10. W tym przykładzie matryca została rozcieńczona przez 10-krotną serię 11 logów, a zatem teoretyczna granica wykrywalności jest wykazana jako 3 kopie (najniższe C_q), chociaż precyzja tego pomiaru jest wyraźnie określona przez odtwarzalność, która jest stosunkowo niska przy tak wysokich cyklach.

Pomiar dynamiczny w oparciu o krzywą standardową.

Rysunek 9.10. Przykład wysokiej powtarzalności i szerokiego zakresu wykrywania przy użyciu seryjnego rozcieńczenia linearyzowanego plazmidu. Dla każdego rozcieńczenia wykonano osiem powtórzeń i wykryto amplifikację celu przy użyciu barwnika SYBR Green I. Kwantyfikacja jest możliwa w zakresie od 3×1010 do 3 kopii.

Wydajność testu jest określana przez pomiar gradientu krzywej standardowej, która jest wykresem logarytmu stężenia docelowego względem C_q  (Rysunek 9.10). Test o wydajności 100% wykazałby podwojenie w każdym cyklu (E=2) i gradient -3,323.

   Wydajność można obliczyć zgodnie z równaniem:

     Wydajność = 10^(-1/slope) -1. Uwaga: oprogramowanie wielu przyrządów zapewnia pomiar wydajności jako
  wartość procentową. Wartość ta jest wartością procentową E=2; zatem wydajność 95% odpowiada E=1,9

     Nachylenie = m i jest określane na podstawie standardowej krzywej równania y=mx+C.

     C jest teoretycznym punktem przecięcia na osi y i zapewnia względną miarę czułości testu.

Nachylenia między -3,1 a -3,6 skutkują skutecznością między 90% a 110% i są zazwyczaj akceptowane, ale ważne jest, aby dążyć do uzyskania wartości tak bliskiej 100%, jak pozwala na to test. Dane przedstawione na Rysunku 9.11 ilustrują normalny zakres zmienności wydajności i czułości serii różnych testów. Pokazuje to, jak ważne jest zgłaszanie tych danych w publikacjach^1,6-8.

Rysunek 9.11. Przykład określenia wydajności i porównania kilku potencjalnych genów referencyjnych. Jak widać, mają one bardzo różne wydajności i czułości (dane dostarczone przez studentów uczestniczących w warsztatach Advanced qPCR, EMBL).

Zaproponowano alternatywne podejścia do obliczania wydajności krzywej standardowej. Metody te podają wydajność pojedynczych reakcji w probówce. Podejścia te opierają się na algorytmach do modelowania krzywych wykresu amplifikacji, a zatem zależą od liczby cykli, w których występuje wzrost fluorescencji. Są one najbardziej skuteczne, gdy pomiar jest wykonywany przy użyciu barwnika wiążącego DNA lub sond Scorpions^® Probes, ponieważ testy te dają większą zmianę fluorescencji na cykl. Chociaż ten rodzaj podejścia potencjalnie stanowi idealną alternatywę dla krzywych standardowych, ta ostatnia jest nadal bardziej powszechną metodą stosowaną do oceny testów. Wynika to z faktu, że krzywe standardowe nie tylko zapewniają oszacowanie wydajności, ale także dostarczają dodatkowych informacji na temat roboczego zakresu dynamicznego, czułości i odtwarzalności oraz są koncepcyjnie łatwiejsze do zastosowania⁹.

Wartość R², czyli to, jak dobrze dane pasują do prostej krzywej standardowej, jest miarą odtwarzalności i ma na nią wpływ dokładność pipetowania oraz zakres dynamiczny testu. Dlatego przy ocenie testów krytyczne jest użycie co najmniej trzech powtórzeń technicznych dla każdego rozcieńczenia. Jeśli R² wynosi ≤0,985, test może nie dawać wiarygodnych wyników, ponieważ odtwarzalność między powtórzeniami jest słaba. Jeśli jeden lub więcej punktów na najniższych poziomach wejściowego kwasu nukleinowego jest przesuniętych poza liniowy obszar wykresu, jest prawdopodobne, że zmierzone stężenie przekracza czułość testu. Jeśli jeden lub więcej punktów przy najwyższej liczbie kopii wejściowego kwasu nukleinowego są przesunięte poza liniowy obszar wykresu, prawdopodobnie reakcja jest nasycona, a stężenie celu przekracza użyteczny zakres testu. Alternatywnie, jeśli kilka losowych punktów znajduje się powyżej lub poniżej linii, problemem może być dokładność pipetowania lub optymalizacja testu. Sprawdź, czy końcówki są prawidłowo dopasowane do pipety i czy dozowana objętość jest powtarzalna oraz zweryfikuj optymalizację starterów, jak opisano powyżej.

Krzywa standardowa jest niezbędnym narzędziem do walidacji reakcji multipleksowych. Prowadzenie wielu reakcji jednocześnie wprowadza konkurencję o odczynniki i pogarsza wszelkie nieoptymalne warunki, powodując poważne zmiany w wydajności PCR. Rysunek 9.12 pokazuje ten punkt. Krzywe wydajności dla dwóch starterów/celów sondy zostały wykonane indywidualnie, a następnie w multipleksie. Wykres pokazuje, że podczas gdy poszczególne reakcje (ciemnoniebieskie i zielone linie) dają stosunkowo podobne wydajności i czułości (wartości osi y), przeprowadzenie reakcji razem dramatycznie zmienia czułość i wydajność reakcji multipleksowej.

Rysunek 9.12. Reakcja singleplex vs reakcja duplex.

Referencje

1. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, et al. 2009. The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. 55(4):611-622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797

2. Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA. 2006. SPUD: A quantitative PCR assay for the detection of inhibitors in nucleic acid preparations. Analytical Biochemistry. 351(2):308-310. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.01.051

3. Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF. 2003. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. Neuroscience Letters. 339(1):62-66. https://doi.org/10.1016/s0304-3940(02)01423-4

4. Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WMH, Karlen Y, Bakker O, van den Hoff MJB, Moorman AFM. 2009. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. 37(6):e45-e45. https://doi.org/10.1093/nar/gkp045

5. Nolan T, Bustin SA. 2013. PCR Technology: Current Innovations. 3. CRC Press.

6. Nolan T, Hands RE, Bustin SA. 2006. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1(3):1559-1582. https://doi.org/10.1038/nprot.2006.236

7. Bustin SA. 2010. Why the need for qPCR publication guidelines??The case for MIQE. Methods. 50(4):217-226. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.12.006

8. Huggett J, Bustin SA. 2011. Standardisation and reporting for nucleic acid quantification. Accred Qual Assur. 16(8-9):399-405. https://doi.org/10.1007/s00769-011-0769-y

9. Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, et al. 2013. Evaluation of qPCR curve analysis methods for reliable biomarker discovery: Bias, resolution, precision, and implications. Methods. 59(1):32-46. https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.08.011