Ilościowa PCR i cyfrowe metody wykrywania PCR
A Technical Guide to PCR Technologies
Wprowadzenie
Barwniki fluorescencyjne lub sondy są zawarte w mieszaninach PCR w celu monitorowania zmian stężenia amplikonu DNA w miarę postępu reakcji. W tym rozdziale omówiono kilka popularnych metod wykrywania, które są dobrze znane z pośredniego pomiaru matrycy w qPCR. Ponadto wykazano, że podwójnie znakowane sondy i niektóre barwniki wiążące DNA dobrze sprawdzają się w cyfrowej reakcji PCR (dPCR).
Przegląd sekcji
Użyj spisu treści po prawej stronie, aby przejść do innych sekcji Przewodnika technicznego po technologiach PCR.
Barwniki wiążące dsDNA
Barwniki wiążące dwuniciowe DNA (dsDNA) działają jako czynniki interkalujące i/lub wiążące rowki podrzędne i emitują wykrywalną fluorescencję, gdy są związane z dsDNA, ale mają bardzo niskie tło, gdy są wolne w roztworze. Dlatego intensywność sygnału fluorescencyjnego wzrasta proporcjonalnie do ilości obecnego amplikonu. Barwniki wiążące dwuniciowe DNA są popularne, ponieważ są tanią opcją wykrywania i nie wymagają dodatkowych rozważań projektowych.
SYBR® Green I Dye
Barwnik ten jest najpopularniejszym barwnikiem wiążącym dsDNA i ma długą historię stosowania w biologii molekularnej. W stanie wolnym w roztworze, gdy obecne jest tylko jednoniciowe DNA (ssDNA), barwnik SYBR Green I emituje sygnał o niskiej intensywności (Rysunek 5.1, Tabela 5.1). Wraz z postępem PCR i wzrostem ilości dsDNA, więcej barwnika wiąże się z amplikonami, a tym samym intensywność sygnału wzrasta (patrz animacja na następującej stronie internetowej sigma.com/sybr-animation). Jednakże, ponieważ barwnik wiąże się ze wszystkimi amplifikowanymi produktami bezkrytycznie, artefakty, takie jak te wynikające z dimerów starterów lub niespecyficznego wiązania starterów, również przyczyniają się do ogólnej fluorescencji. Może to utrudniać uzyskanie dokładnej kwantyfikacji, zwłaszcza przy niskich stężeniach matrycy. Jednak analiza krzywej topnienia po PCR może pomóc w określeniu specyficzności reakcji1 (Rysunek 5.2).
Rysunek 5.1.Barwnik SYBR Green I przechodzi cyklicznie między stanem niezwiązanym (denaturacja) i związanym (annealing przez wydłużenie) w miarę postępu reakcji, a intensywność sygnału wzrasta wraz ze wzrostem ilości amplikonów.
aPo skompleksowaniu z dsDNA
Rysunek 5.2.Przykładowa analiza krzywej topnienia. Barwniki wiążące dsDNA wiążą się odwracalnie, więc intensywność fluorescencji spada wraz ze wzrostem temperatury reakcji powyżej temperatury topnienia (Tm). W połączeniu z kontrolami, ten rodzaj analizy umożliwia wykrywanie niespecyficznych produktów, które topią się w innych temperaturach niż specyficzny produkt.
Sondy
We wszystkich zastosowaniach qPCR, reakcja amplifikacji jest napędzana przez specyficzne startery do przodu i do tyłu. Jednakże, w przeciwieństwie do testów polegających na wykrywaniu przy użyciu barwników wiążących dsDNA, systemy wykrywania sond nie zawierają wolnego barwnika, ale raczej trzeci oligonukleotyd (a czasem czwarty) sprzężony z barwnikiem reporterowym i/lub cząsteczką wygaszającą.
Sondy podwójnie znakowane
Sondy podwójnie znakowane (znane również jako hydrolizujące lub alternatywnie TaqMan® sondy) są używane w teście 5' nukleazy2,3, który jest najpopularniejszą chemią wykrywania sond (Rysunek 5.3; zobacz także animację na następującej stronie internetowej: sigma.com/probe-animation). Sonda podwójnie znakowana to jednoniciowy oligonukleotyd znakowany barwnikiem reporterowym i cząsteczką wygaszającą. Reporter znajduje się na końcu 5', a wygaszacz na końcu 3'. Wygaszacz pochłania naturalną emisję fluorescencji reportera, zwykle poprzez transfer energii typu Forstera, częściej określany jako transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET). Po amplifikacji ze startera do przodu, polimeraza Taq DNA napotyka sondę. Aktywność egzonukleazy 5' charakterystyczna dla polimerazy Taq DNA oddziela następnie reporter 5' od wygaszacza 3' (Tabela 5.2, Rysunek 5.3), co zapewnia sygnał fluorescencyjny, który jest proporcjonalny do wydajności amplikonu.
Test sondy hydrolizy jest specyficzny i dokładny dla kwantyfikacji celów o niskiej liczbie kopii. Specyficzność można jeszcze bardziej poprawić poprzez włączenie do sondy zmodyfikowanych nukleotydów, takich jak zablokowany kwas nukleinowy (jak opisano poniżej). Sondy zmodyfikowane zablokowanym kwasem nukleinowym są szczególnie przydatne do rozróżniania polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP) lub innych podobnych sekwencji. Podwójnie znakowane sondy wymagają starannego projektowania (PCR/qPCR/dPCR Assay Design) i są generalnie droższe niż barwniki wiążące dsDNA. Ponadto, podczas gdy amplifikacja niespecyficznych produktów może pozostać niewykryta, reakcje uboczne mogą spowodować, że ogólna reakcja będzie mniej wydajna, a zatem testy zawierające sondy mogą nadal korzystać z optymalizacji (Oczyszczanie próbek i ocena jakości).
Rysunek 5.3.Mechanizm działania podwójnie znakowanych sond. Polimeraza DNA Taq wydłuża starter znajdujący się na tej samej nici co sonda, aż osiągnie pozycję sondy. Wrodzona aktywność egzonukleazy hydrolizuje sondę od 5' do 3', co uwalnia barwnik reporterowy do roztworu, a tym samym powoduje wzrost fluorescencji. Zmierzony sygnał fluorescencji jest wprost proporcjonalny do ilości docelowego DNA.
Większość termocyklerów do PCR w czasie rzeczywistym ma wiele kanałów detekcji, co zapewnia elastyczność w wyborze etykiet sond. Bardzo ważne jest, aby wybrać barwniki reporterowe, które są kompatybilne z kanałami detekcji urządzenia i upewnić się, że stosowane są odpowiednie filtry i kalibracja. Podczas multipleksowania wymagane są kombinacje reporterów, które są jak najbardziej od siebie różne, aby zminimalizować wzajemne oddziaływanie optyczne. Typowe reportery obejmują: FAM, HEX, TxRd (Sulforhodamine 101-X) i cyjanina 5. W identycznych warunkach zwykle obserwuje się różnice w intensywności emisji różnych reporterów. Z tego powodu zaleca się analizowanie danych z każdej kombinacji reporterów niezależnie (przy użyciu różnych ustawień progowych, odpowiednio do emisji sondy).
Beacony molekularne
Beacony molekularne (znane również jako sondy hybrydyzacyjne) są jednoniciowymi sondami, które są utrzymywane w konformacji pętli spinki do włosów (20-25 nukleotydów) przez komplementarne sekwencje macierzyste (4-6 nukleotydów) na każdym końcu4 (Rysunek 5.4). Pętla spinki do włosów jest komplementarna do matrycy, a sekwencje macierzyste z wiązaniami wodorowymi umożliwiają wygaszaczowi 3' tłumienie fluorescencji reportera 5' (Tabela 5.3), gdy sonda jest wolna w roztworze.
Rysunek 5.4.Mechanizm działania sygnalizatorów molekularnych. Molekularne sygnały nawigacyjne hybrydyzują z określoną sekwencją docelową, powodując otwarcie struktury pętli spinki do włosów, oddzielając reporter 5' od wygaszacza 3'. Ponieważ wygaszacz nie znajduje się już w pobliżu reportera, następuje emisja fluorescencji. W przeciwieństwie do sond podwójnie znakowanych, mechanizm wykrywania Molecular Beacons nie opiera się na degradacji podczas reakcji. Zmierzony sygnał fluorescencji jest wprost proporcjonalny do ilości docelowego DNA.
LightCycler® Sondy
Sonda LightCycler lub system FRET (znany również jako sondy do podwójnej hybrydyzacji) składa się z pary jednoniciowych oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie5,6 (Rys. 5.5). Sonda oligonukleotydowa 1 jest znakowana na końcu 3' barwnikiem fluoroforowym donorowym, a sonda oligonukleotydowa 2 jest znakowana na końcu 5' jednym z kilku dostępnych barwników fluoroforowych akceptorowych (Tabela 5.4). Wolna 3' grupa hydroksylowa Oligo Probe 2 musi być zablokowana grupą fosforanową, aby zapobiec wydłużeniu polimerazy DNA.
Rysunek 5.5.Mechanizm działania sond FRET LightCycler. Podczas etapu annealingu, startery i obie sondy hybrydyzują ze swoimi specyficznymi regionami docelowymi, zbliżając barwnik donorowy do barwnika akceptorowego (sondy są zwykle oddalone od siebie o 1 do 5 nukleotydów). Gdy donor jest wzbudzany przez światło z urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym, energia jest przenoszona przez FRET od donora do akceptora. Długość fali emisji barwnika na sondzie akceptora jest wykrywana. Wzrost sygnału fluorescencji jest wprost proporcjonalny do ilości docelowego DNA.
Sondy Scorpions® Probes
Sondy Scorpions® są dostępne w dwóch formach: uni-probe i bi-probe. Sonda uni-probe składa się ze struktury pętli macierzystej, podobnej do Molecular Beacon, ale jest ona dołączona do startera do przodu z blokerem PCR umieszczonym między dwiema sekcjami oligo7 (bloker zapobiega wydłużaniu startera przez polimerazę Taq DNA (Rysunek 5.6A, Tabela 5.5).
Struktura bi-probe jest dupleksem z 5' reporterem, sekwencją sondy, blokerem PCR i starterem do przodu na jednej nici i 3' wygaszaczem na drugiej nici; nić wygaszacza jest dupleksowana z nicią reportera (Rys. 5.6B).
Rysunek 5.6.Mechanizm działania sond Scorpions®. Sonda uni-probe A) ma wszystkie składniki sondy na jednej nici, podczas gdy sonda bi-probe B) ma składniki sondy na dwóch niciach. Oba formaty sond Scorpions® zawierają starter PCR do przodu. Ten starter jest przedłużany, aby stać się częścią nowo utworzonego amplikonu. Podczas annealingu/rozszerzania sekwencja sondy w Scorpions® hybrydyzuje z matrycą, co powoduje oddzielenie reportera od wygaszacza, a tym samym daje sygnał fluorescencyjny. Ponieważ ogon Scorpions® i amplikon są częścią tej samej nici, interakcja wykrywania jest wewnątrzcząsteczkowa, a zatem szybsza niż w przypadku innych systemów wykrywania sond. Szablon jest zwykle wybierany w odległości od 5 do 50 zasad od 3' końca startera Scorpions®. Zarówno jednosonda, jak i dwusonda Scorpions® wymagają oddzielnego startera odwrotnego.
Quenchers
Większość systemów detekcji sond wymaga obecności ugaszacza. Niektóre z tych stosowanych w oryginalnych strukturach sond były akceptorowymi barwnikami fluorescencyjnymi, np. TAMRA, które dobrze współpracują z FAM, ale nie są odpowiednie dla innych barwników. Jako sam barwnik reporterowy, TAMRA wytwarza fluorescencję i dlatego może powodować słaby stosunek sygnału do szumu. Z tego powodu firma Biosearch Technologies opracowała ciemne wygaszacze, które emitują ciepło zamiast światła, takie jak Black Hole Quencher® (BHQ®). Wybór ciemnych wygaszaczy jako popularnych alternatyw dla cząsteczek barwników zapewnia wygaszanie w szerokim zakresie długości fal i otwiera możliwość reakcji multipleksowych zawierających większą liczbę kombinacji cel/sonda.
Onyx Quencher™ (OQ™) to zastrzeżony ciemny wygaszacz firmy Sigma-Aldrich. Dostępne są cztery wersje pochodne (OQA, OQB, OQC i OQD). Jak pokazano w Tabeli 5.6, cztery wygaszacze Onyx są kompatybilne z wieloma popularnymi barwnikami reporterowymi.
Dane przedstawione na Rysunku 5.7 pokazują amplifikację sztucznej matrycy pochodzącej z syntetycznego oligo w celu optymalizacji testu docelowego Schistosoma mansoni8. Do detekcji użyto sondy znakowanej FAM z porównywalnym ciemnym wygaszaczem, CDQ (A) lub OQA (B). Z tych danych wynika, że zarówno CDQ, jak i OQA mają równoważną wydajność, z podobną fluorescencją tła i podobnymi wartościami Cq dla analizowanych danych z szablonu o tym samym stężeniu.
Podsumowując, OQ jest równoważny pod względem wydajności z CDQ i co ważne, jest dostępny bez licencji, ograniczeń i opłat licencyjnych dla każdego zastosowania. To sprawia, że Onyx Quencher jest doskonałym i opłacalnym wyborem do opracowywania komercyjnych zestawów i odczynników do diagnostyki molekularnej, które zawierają sondy qPCR.
Rysunek 5.7.Rozcieńczenia sztucznego oligo amplifikowano przy użyciu starterów 250 nM, a amplikon wykryto za pomocą podwójnie znakowanej sondy przy 200 nM. A) Sonda została wyznakowana FAM i wygaszona CDQ lub OQA (jak wskazano), a surowe dane fluorescencji są pokazane. B) Sonda została wyznakowana FAM i wygaszona CDQ lub OQA i pokazano dane skorygowane o linię bazową. Nie ma znaczących różnic między wydajnością obu sond.
Analogi kwasów nukleinowych
Do produkcji oligonukleotydów o zmienionych właściwościach biochemicznych można wykorzystać szereg modyfikacji. Modyfikacje te generalnie nadają wyższy Tm którym można manipulować w celu zapewnienia lepszej specyficzności. Pozwala to na projektowanie testów w regionach o trudnej sekwencji lub gdy pojedynczy oligonukleotyd jest wymagany do wykrywania kilku sekwencji, np,
Zablokowany kwas nukleinowy
Zablokowany kwas nukleinowy jest analogiem RNA (Rysunek 5.8), który zapewnia zwiększoną czułość i specyficzność po włączeniu do sond9. Sondy z zablokowanymi zasadami kwasu nukleinowego mają większą stabilność termiczną i dlatego silniej hybrydyzują z matrycą. Każda zablokowana zasada kwasu nukleinowego może zwiększyć Tm sondy nawet o 8°C10, co sprawia, że zablokowany kwas nukleinowy jest potężnym narzędziem w testach rozróżniania SNP11 (niedopasowanie pojedynczej zasady ma większy destabilizujący wpływ na tworzenie dupleksu niż bez zablokowanego kwasu nukleinowego), multipleksowanie (pozwala na prostsze Tm optymalizację) i problematyczne sekwencje docelowe (sondy z zablokowanym kwasem nukleinowym mogą być krótsze, co pozwala na ich projektowanie wokół problemów, takich jak regiony bogate w AT lub GC, sekwencje powtarzalne lub sekwencje o znaczącej strukturze drugorzędowej). Primery PCR zawierające zablokowany kwas nukleinowy okazały się również korzystne w zastosowaniach takich jak genotypowanie SNP12.
Zablokowany kwas nukleinowy zapewnia również ochronę przed trawieniem przez nukleazy, dzięki czemu nadaje się do stosowania in vivo13.
Rysunek 5.8.Porównanie struktur zablokowanego kwasu nukleinowego i nukleotydów DNA. Zablokowany kwas nukleinowy różni się od DNA tym, że zablokowany kwas nukleinowy zawiera rybozę z mostkiem metylenowym między tlenem 2' a węglem 4', który "blokuje" rybozę w konformacji endo 3', podczas gdy DNA zawiera 2'-deoksyrybozę bez mostka metylenowego.
Podsumowanie
Przy wyborze metody detekcji dla konkretnego zastosowania należy wziąć pod uwagę wiele czynników. Podczas gdy barwniki SYBR Green I i testy z podwójnie znakowaną sondą są popularne i generalnie działają dobrze, istnieją sytuacje, w których inne systemy wykrywania mogą być preferowane. Tabela 5.7 może być używana jako wskazówka podczas wczesnego opracowywania testów.
Puste miejsca oznaczają, że metoda wykrywania nie jest zalecana; X = dobra wydajność; oraz XX = lepsza wydajność.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?