Protokoły komórek kompetentnych
Wprowadzenie
Transformacja to proces, w którym niektóre bakterie pobierają obcy materiał genetyczny (nagie DNA) ze środowiska. Po przedostaniu się do cytoplazmy, materiał genetyczny może zostać zdegradowany przez nukleazy, jeśli różni się od bakteryjnego DNA. Jeśli egzogenny materiał genetyczny jest podobny do bakteryjnego DNA, może zostać zintegrowany z chromosomem. Czasami egzogenny materiał genetyczny może współistnieć jako plazmid z chromosomalnym DNA.
Nie wszystkie bakterie są zdolne do pobierania egzogennego DNA ze swojego środowiska. Aby bakteria mogła pobrać DNA, musi być kompetentna. Bakterie mogą być naturalnie kompetentne lub kompetentne dzięki sztucznym metodom. Czynniki regulujące naturalną kompetencję różnią się w zależności od rodzaju. Praktyczne podejście do pozyskiwania kompetentnych komórek polega na sztucznym uzyskaniu kompetencji komórek bakteryjnych przy użyciu środków chemicznych lub impulsów elektrycznych.
- Chemiczna indukcja kompetencji obejmuje następujące etapy:
- schładzanie komórek w obecności fosforanu wapnia (nr kat. CAPHOS), aby uczynić je przepuszczalnymi
- inkubacja z DNA
- obróbka szokiem cieplnym w temperaturze 42 °C przez 60-120 sekund, która powoduje, że DNA wchodzi do komórek
Uwaga: Aby wytrzymać obróbkę szokiem cieplnym, ważne jest, aby używane komórki były w fazie logarytmicznego wzrostu.
- Alternatywnie, komórki bakteryjne są przepuszczalne poprzez poddanie ich impulsom elektrycznym, proces znany jako elektroporacja.
Zjawisko transformacji jest szeroko stosowane w biologii molekularnej. Bakterie mogą być wykorzystywane jako komórki gospodarza do tworzenia kopii DNA, klonowania, ekspresji dużych ilości białek, generowania bibliotek cDNA oraz w badaniach nad powiązaniami DNA, ponieważ można je łatwo hodować w dużych ilościach.
Kompetentne komórki dostępne w naszym katalogu
Oferujemy szereg Escherichia coli komórek bakteryjnych uzyskanych z najwyższą wydajnością dzięki zoptymalizowanej procedurze specyficznej dla każdego szczepu. Wybierz spośród 24 nowych kompetentnych komórek do szerokiej gamy zastosowań, w tym ekspresji białek, rutynowego lub trudnego klonowania i generowania bibliotek. Dostępnych jest wiele rozmiarów próbnych!
Protokoły
Rzeczy do zrobienia przed rozpoczęciem transformacji:
- Przygotuj płytki z agarem LB i pozostaw do zżelowania. Jeśli używane są wstępnie wylane płytki, upewnij się, że płytki są ogrzane do 37 °C.
- W zależności od markera antybiotykowego obecnego w DNA plazmidu, dodaj odpowiedni antybiotyk do agaru LB.
- Jeśli wymagane jest niebieskie/białe badanie przesiewowe dla rekombinantów, dodaj 1mM IPTG, 300µg/ml S-Gal lub 40µg/ml X-Gal i 500µg/ml cytrynianu żelazowo-amonowego do agaru LB.
- Jeśli używane są komórki elektrokompetentne, umieść komorę do elektroporacji na lodzie.
- Podgrzej łaźnię wodną do 37°C.
- Podgrzej sterylne podłoże SOC do temperatury pokojowej (lub 20-25°C w łaźni wodnej).
Protokół transformacji przy użyciu chemicznie kompetentnych komórek
Materiały wymagane, ale niedostarczone:
Standardowy protokół transformacji:
- Przenieś wymaganą liczbę probówek z zamrażarki -70 °C do mokrego lodu. W razie potrzeby dołącz dodatkową probówkę na kontrolne DNA.
- Pozwól komórkom rozmrażać się przez 5 minut. Delikatnie postukaj w probówki wiele razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
- Dodaj 1-50ng oczyszczonego plazmidowego DNA bezpośrednio do komórek w pozostałych probówkach. Wymieszać przez delikatne stukanie i umieścić na lodzie.
Uwaga: Dla kontroli: Dodaj 1 µl (10 ng) kontrolnego DNA pUC19 do jednej probówki. Wymieszaj delikatnie stukając i umieść na lodzie. - Inkubuj komórki na lodzie przez 30 minut.
- Przenieś komórki do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na dokładnie 45 sekund.
- Przenieś komórki na lód na 2 minuty.
- Dodaj pożywkę SOC do każdej probówki. Przenieś komórki do sterylnych probówek polipropylenowych i poluzuj zakrętki, aby ułatwić napowietrzanie hodowli.
- Inkubuj komórki w inkubatorze z wytrząsarką (225-250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Nanieść pipetą 10-100 µl każdej zawiesiny transformowanych komórek na płytki z agarem LB z antybiotykiem selekcyjnym i rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza.
- Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
- Wybierz kolonię (kolonie) i hoduj w razie potrzeby.
- Wyizoluj plazmidowe DNA z każdej kultury.
- Strawienie plazmidowego DNA przy użyciu enzymów restrykcyjnych; oddzielenie przez elektroforezę żelową.
- Hoduj preferowane klony.
Protokół transformacji przy użyciu komórek elektrokompetentnych
Materiały wymagane, ale niedostarczane:
Standardowy protokół transformacji:
- Przenieś wymaganą liczbę probówek z zamrażarki -70 °C do mokrego lodu. W razie potrzeby dołącz dodatkową probówkę na kontrolne DNA.
- Pozwól komórkom rozmrażać się przez 5 minut. Delikatnie postukaj w probówki wiele razy, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
- Przenieś pożywkę SOC do probówek hodowlanych, po jednej dla każdej reakcji transformacji i pozostaw w temperaturze pokojowej.
Uwaga: Objętość pożywki SOC zależy od objętości komórek, które zostaną dodane w następnym kroku. Końcowa objętość z kompetentnymi komórkami i pożywką SOC powinna wynosić 1000 µl. - Umieść standardowe kuwety 1 mm i sterylne probówki do mikrowirówki na lodzie, po jednej dla każdej reakcji transformacji.
- Przenieś kompetentne komórki do schłodzonych probówek do mikrowirówki. Użyj 40 µl komórek z opakowania 80 µl i 50 µl komórek z opakowania 100 µl.
- Przygotuj 5-krotne rozcieńczenie DNA lub mieszaniny ligacyjnej w buforze TE. Dodać do mikroprobówek.
Uwaga: Dla kontroli: Dodaj 1µL 5-krotnego rozcieńczenia kontrolnego DNA pUC19 do jednej probówki. - Pipetuj mieszaninę DNA i komórek do schłodzonej kuwety 1mm.
- Ustaw elektroporator na natężenie pola 25kV/cm na 6ms i poddaj komórki działaniu.
- Wyjmij komórki z kuwet i dodaj do probówek zawierających pożywkę SOC.
- Inkubuj komórki w inkubatorze z wytrząsarką (225-250 obr./min) w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Nanieś pipetą 10-100 µl każdej zawiesiny transformowanych komórek na płytki agarowe LB z antybiotykiem selekcyjnym i rozprowadź za pomocą sterylnego rozsiewacza.
- Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc.
- Wybrać kolonię i hodować w razie potrzeby.
- Wyizolować plazmidowe DNA z każdej hodowli.
- Trawić plazmidowe DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych i oddzielić za pomocą elektroforezy żelowej.
- Hodować preferowane klony.
Ważne wskazówki dotyczące optymalizacji procesu transformacji:
- Potwierdź, że komórki są nadal zamrożone, a suchy lód jest nadal obecny po ich otrzymaniu.
- Dla maksymalnej wydajności transformacji, użyj wysokiej jakości próbki DNA wolnej od fenolu, etanolu, białek, soli lub detergentów. Podczas korzystania z komórek elektrokompetentnych, wysoka zawartość soli w DNA spowoduje powstanie łuku elektrycznego przy wysokim napięciu, co może uszkodzić próbkę i sprzęt.
- DNA w reakcjach ligacji zawierających wysokiej jakości odczynniki może być używane do transformacji. Ligaza DNA nie musi być inaktywowana.
- Kompetentne komórki należy trzymać na lodzie przez cały czas; należy zapobiegać przypadkowemu ogrzaniu komórek.
- Delikatnie uderzaj w probówki, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Nie mieszać za pomocą worteksu lub pipety.
- Płytki z agarem LB ogrzać do temperatury 37 °C dla optymalnego wzrostu kolonii.
- Ustawienia elektroporatora do transformacji przy użyciu komórek elektrokompetentnych:
- BTX Model ECM 630: Tryb HV, 2.5kV, 25µF, 100Ω, kuweta 1mm
- BioRad Gene Pulser: 2.5kV, 25µF, 100Ω, kuweta 1mm
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?