Analiza macierzowa CGH trudnych próbek

Sunny Song¹, Jim Collins¹, Steve Michalik², Chad Brueck²

¹Agilent Technologies, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara, CA, 95051, ²MilliporeSigma, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO, 63103 AACR, April 2007 Poster # 3792

Czytaj więcej o

• Wprowadzenie
• Wyniki
• Przypisy
• Wnioski
• Materials
• References

Wprowadzenie

W ostatnich latach, oparta na macierzach porównawcza hybrydyzacja genomowa (aCGH) została udoskonalona w celu określenia zmian chromosomalnych w coraz wyższych rozdzielczościach¹. Ta rozwijająca się technologia jest jednak utrudniona przez duże wymagania wejściowe DNA - do przetworzenia jednej macierzy CGH potrzeba co najmniej 150 000 kopii ludzkiego genomu lub 0,5 μg na próbkę. Często dostępne tkanki pobrane od pacjenta, takie jak małe biopsje igłowe, mogą ograniczać zakres dalszej analizy. GenomePlex^® amplifikacja całego genomu (WGA) zapewnia sposób na zmniejszenie ilości wymaganego DNA do aCGH, oprócz innych analiz. Wykazano również, że produkt WGA działa na macierzach BAC^{2, 3} i innych platformach macierzy oligo⁴. Amplifikacja DNA może rozszerzyć liczbę i zakres zastosowań, takich jak profilowanie mikromacierzy, do analizy nanogramowych ilości DNA, a nawet pojedynczych komórek. Co więcej, i być może bardziej interesujące, GenomePlex WGA umożliwia badaczom reprezentatywną amplifikację genomu z próbek, które zostały pofragmentowane do średniego rozmiaru mniejszego niż 1 kb.

Wyniki

100 ng do 1 ng wejściowego DNA

Rysunek 1. Wejściowe dane miareczkowania z mikromacierzy Agilent Human Genome CGH 105A

W każdym panelu (A-F) przedstawiono obok siebie wykresy zamiany barwników. Polaryzacja +1 (Cy5-HT29/Cy3-Kobieta) jest pokazana po lewej stronie, a polaryzacja -1 (Cy5-Kobieta/Cy3-HT29) jest pokazana po prawej stronie. Te wykresy CGH porównują normalne kobiece DNA z DNA ludzkiej linii komórkowej raka okrężnicy HT29, która ma znaną delecję w ramieniu p (poziome przesunięcie w lewo od linii zerowej), amplifikację ramienia q w regionie q23.3-24.33 (poziome przesunięcie w prawo od linii zerowej) i ogniskową delecję w q23.1. Na tych próbkach przeprowadzono zamianę barwników (przełączanie etykiet barwników między próbkami), aby wykazać, że wyniki nie były efektem stronniczości barwnika. Pochodne wartości odchylenia standardowego Log2Ratio (DLRSD) są pokazane pod wykresami. Wskaźniki jakości macierzy przedstawiono w tabeli 1.

A: Amplifikacja od 100 ng materiału wejściowego
B: Amplifikacja od 50 ng materiału wejściowego
C: Amplifikacja od 10 ng materiału wejściowego
D: Amplifikacja od 1 ng materiału wejściowego
E: Brak amplifikacji

Tabela 1: Wskaźniki wydajności macierzy / wyniki kontroli jakości (patrz przypis w celu uzyskania dalszych wyjaśnień)

	SNR-Cy3	SNR-Cy5	BG Noise-Cy3	BG Noise-Cy5
Amplified (100 ng input)	137	192	1.9	2.6
Amplified (50 ng input)	118	190	2.4	2.9
Amplified (10 ng input)	94	202	2.4	2.3
Amplified (1 ng input)	142	221	1.7	2.2
Unamplified (500 ng input)	155	190	2.0	3.1

Obraz żelu, przebieg czasu sonikacji genomowego DNA

Rysunek 2. 1,2% analiza elektroforezy w żelu agarozowym pofragmentowanego DNA

Rozmiar fragmentu DNA określono za pomocą elektroforezy żelowej przed amplifikacją za pomocą GenomePlex WGA. Zarówno ludzkie żeńskie genomowe DNA, jak i genomowe DNA HT29 dają nienaruszone pasmo o wysokiej masie cząsteczkowej (> 12 000 bp), podczas gdy DNA było poddawane sonikacji przez 5 do 120 sekund, aby uzyskać rozmazy DNA o różnych rozmiarach. Próbki sonikowane przez 90 sekund (200-1500 bp, pasy 5 i 9) zostały wykorzystane w późniejszej analizie aCGH.

Pas 1 & 7: Marker masy cząsteczkowej
Pas 2: Nienaruszone żeńskie DNA (> 12,000 bp)
Pas 3: Kobiece DNA poddane sonikacji przez 5 sekund (400 - 10 000 bp)
Pas 4: Kobiece DNA poddane sonikacji przez 30 sekund (250 - 1 500 bp)
Pas 5: Kobiece DNA poddane działaniu ultradźwięków przez 90 sekund (200 - 1200 bp)
Pas 6: Kobiece DNA poddane działaniu ultradźwięków przez 120 sekund (150 - 600 bp)
Pas 8: Nienaruszone DNA HT29 (> 12,000 bp)
Lane 9: DNA HT29 poddane sonikacji przez 90 sekund

GenomePlex WGA może amplifikować DNA poniżej 1kb z wynikami równoważnymi z nienaruszonym DNA.

Rysunek 3. Widoki CGH Analytics mikromacierzy Agilent Human Genome CGH 44B chromosomu 8 w ludzkiej linii komórkowej raka okrężnicy HT29 vs. normalna kobieta

Produkt WGA wygenerowany z nienaruszonego DNA HT29 (A) i sonikowanego (90 s) DNA HT29 (B) ujawnił identyczną znaną delecję w ramieniu 8p (poziome przesunięcie w lewo od linii zerowej), amplifikację wzdłuż ramienia 8q w regionie 8q23.3-24.23 (poziome przesunięcie w prawo od linii zerowej) oraz ogniskową delecję w 8q23.1 (poziome przesunięcie w lewo od linii zerowej, zaznaczone przerywaną niebieską ramką). Odpowiednie powiększone widoki genów dla danych zarówno z nienaruszonego DNA (C), jak i pofragmentowanego DNA (D), skupiające się na Chr8 q22.2-23.1, pokazują wyraźną delecję ~ 1,5 MB (zaznaczoną grubą linią) obejmującą białko palca cynkowego ZFPM2 i supresor nowotworu LRP12, które zostały wcześniej zgłoszone w analizach opartych na macierzach BAC.

A: Widok chromosomu 8 amplifikowanego nienaruszonego DNA porównującego HT29/Kobieta (50 ng danych wejściowych)
B: Widok chromosomu 8 amplifikowanego sonikowanego 90-sekundowego DNA porównującego HT29/Kobieta (50 ng danych wejściowych)
C: Powiększony widok genu panelu A (okno powiększenia 12 MB)
D: Powiększony widok genu panelu B (okno powiększenia 12 MB)

Identyfikacja ogniskowej delecji za pomocą mikromacierzy Agilent Human Genome CGH 244K przy użyciu amplifikowanego lub nieamplifikowanego DNA GenomePlex.

Rysunek 4. Widoki CGH Analytics analiz Agilent 244K (5) ludzkiego zamrożonego guza piersi w porównaniu z normalną kobietą

Wykres rozrzutu (widok chromosomu) uzyskany z analizy mikromacierzy 244K ujawnia ogniskową delecję w regionie chromosomu 13 p13.1 (poziome przesunięcie na lewo od linii zerowej, zaznaczone przerywaną niebieską ramką) zarówno w próbkach amplifikowanych (A), jak i nieamplifikowanych (B). Odpowiadający powiększony widok genu (C = amplifikowany, D = nieamplifikowany), który koncentruje się na oknie 3,7 MB w 13p13.1 zawierającym ogniskowe delecje. Wiele wzorów delecji obejmujących gen raka piersi BRCA2 (oznaczony czerwonym paskiem) w obrębie ogniskowej delecji 1,5 MB w ramieniu 13p 13.1 zidentyfikowano zarówno za pomocą produktu WGA, jak i nieamplifikowanego genomowego DNA wygenerowanego z DNA guza piersi.

A: Guz piersi vs. normalna kobieta Chr13, Amplifikacja WGA (50 ng danych wejściowych)
B: Guz piersi vs. normalna kobieta Chr13, Nieamplifikowany genomowy DNA wygenerowany z DNA guza piersi. Chr13, bez amplifikacji (500 ng danych wejściowych)
C: Powiększony widok genu w panelu A (okno 3,7 MB)
D: Powiększony widok genu w panelu B (okno 3,7 MB)

Weryfikacja danych aCGH raka piersi przy użyciu ilościowego PCR specyficznego dla genu BRCA2

Rysunek 5: Średnia z trzech zestawów starterów do ilościowej PCR SYBR Green ukierunkowanych na eksony 2, 3 i 26 (6) genu BRCA2 wykazała różnicę 1,54 cyklu między DNA guza piersi a prawidłowym DNA kobiety. Ten 2,9-krotny (2^1,54) spadek reprezentacji genu BRCA2 z próbki guza w porównaniu z próbką prawidłową potwierdza ogniskową heterozygotyczną delecję 13 p13.1.

Footnotes

Array Performance/QC Metrics (CGH Analytics 3.4 software QC metrics)

DLRSD	Derivative Log2 Ratio Standard Deviation	Odchylenie standardowe log2 kolejnych sond podzielone przez sqrt(2).br> Ratio Standard Deviation	Odchylenie standardowe logarytmu różnic między kolejnymi sondami podzielone przez sqrt(2). Ta metryka oblicza współczynnik logarytmiczny szumu między sondami w tablicy.	Doskonały: <0.2 Dobry: 0.2-0.3 Słaby: >0.3
BGNoise	Hałas tła	Ta metryka jest obliczana jako odchylenie standardowe negatywnych sond kontrolnych.br> ujemnych sond kontrolnych po odrzuceniu cech niejednorodnych odstających, cech nasyconych i cech odstających populacji	Doskonały: 5 Dobry: 5-10 Słaby: >10
SNR	Signal to Noise Ratio	Ta metryka jest obliczana jako intensywność sygnału podzielona przez BGNoise.	Doskonały: >100 Dobry: 30-100 Słaby: <30

Wnioski

Ta metoda amplifikacji pozwala na stosowanie mniejszych ilości (nanogramowych) materiału wyjściowego i jest w stanie unieśmiertelnić cenne próbki poprzez kolejne reamplifikacje. Poza pominięciem wstępnego trawienia enzymami restrykcyjnymi, DNA WGA może być bezpośrednio włączone do przepływu pracy oligo-aCGH bez większych odstępstw od protokołu zalecanego przez Agilent. Amplifikowany materiał generuje wysokiej jakości dane CGH, które odpowiadają wynikom z nieamplifikowanych próbek genomowego DNA. Przyszłe eksperymenty będą koncentrować się na tworzeniu wysokiej jakości profili genomowych z próbek tkanek, w tym próbek FFPE i LCM ⁷.

Referencje

1. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, Sampas N, Lipson D, Kincaid R, Tsang P, Curry B, Baird K, Meltzer PS, et al. 2004. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(51):17765-17770. https://doi.org/10.1073/pnas.0407979101

2. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441

3. Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. 2006. Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA. Genomics. 87(2):298-306. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2005.09.019

4. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, Farnham PJ. 2006. Comparison of sample preparation methods for ChIP-chip assays. BioTechniques. 41(5):577-580. https://doi.org/10.2144/000112268

5. 2007. Agilent Human, Mouse and Rat Genome CGH Microarrays, 244A and 105A . [Internet]. USA : Agilent Technologies, Inc . Available from: http://www.koreabiomics.com/avi/CGH%20array.pdf

6. Tavtigian Sea. 1996. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13qlinked kindreds. . Nature Genetics . 12 333-337.

7. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441