Kwantyfikacja oligonukleotydów

Oligonukleotydy to krótkie, jedno- lub dwuniciowe polimery kwasów nukleinowych. Stężenie kwasów nukleinowych w roztworze można łatwo określić ilościowo w spektrofotometrze po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego (UV) o długości fali 260 nm (Rysunek 1). Technika ta działa, ponieważ zasady mają sprzężone wiązania podwójne, które absorbują światło UV w różny sposób. 

Rysunek 1. Absorbancja w spektrofotometrze. Kwas nukleinowy w roztworze w próbówce jest oświetlany padającym światłem UV o maksymalnej intensywności 260 nm. Ponieważ zasady kwasu nukleinowego pochłaniają część światła UV, natężenie przepuszczanego światła UV jest zmniejszone. Absorbancja jest określana według następującego wzoru:

Gdzie: A₂₆₀ = absorbancja przy 260 nm; I_o = natężenie światła padającego; oraz, I = natężenie światła przechodzącego.

Po odczycie absorbancji, w grę wchodzi prawo Beera-Lamberta, które odnosi wielkość absorbancji do stężenia absorbującego kwasu nukleinowego w następujący sposób:

Gdzie:

A₂₆₀ = absorbancja przy 260 nm

��₂₆₀ = współczynnik ekstynkcji oligonukleotydu przy 260 nm w L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

c    = stężenie w mol L^-1

ℓ    = długość ścieżki w cm

Kluczem do prawa Beera-Lamberta jest współczynnik ekstynkcji, który mierzy, jak silnie absorbujące zasady zmniejszają intensywność światła UV od padania do transmisji. Ponieważ absorbancja każdej zasady jest inna, skład zasady, kolejność zasad i długość sekwencji będą miały wpływ na ostateczną absorbancję konkretnego kwasu nukleinowego poddawanego kwantyfikacji. Dlatego największą dokładność uzyskuje się, gdy współczynnik ekstynkcji jest obliczany dla każdego oligonukleotydu. Model najbliższych sąsiadów jest idealny dla oligonukleotydów, a wzór jest następujący:

Tabele 1 i 2 wyświetlają współczynniki ekstynkcji najbliższego sąsiada i poszczególnych zasad, które należy stosować we wzorze najbliższego sąsiada podczas obliczania końcowego, całkowitego współczynnika ekstynkcji oligonukleotydu.

Tabela 1. Współczynniki ekstynkcji najbliższych sąsiadów w L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1 Wzór na najbliższe sąsiedztwo traktuje zasady w najbliższym sąsiedztwie jako dinukleotydy, więc współczynniki ekstynkcji są określane dla par poprzez odczyt od pozycji 5' do 3'. Na przykład dla tetranukleotydu 5'-ACGT-3' istnieją trzy dinukleotydy (AC, CG i GT). Współczynniki ekstynkcji dla tych par wynoszą odpowiednio 21 200, 18 000 i 20 000 L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1.

	3' Pozycja
5' Pozycja	Bazy	A	C	G	T
	A	27,400	21,200	25,000	22,800
	C	21,200	14,600	18,000	15,200
	G	25,200	17,600	21,600	20,000
	T	23,400	16,200	19,000	16,800

Tabela 2. Współczynniki ekstynkcji poszczególnych baz w L ⋅ mol-1 ⋅ cm-1 Wzór na najbliższe sąsiedztwo traktuje zasady w wyrażeniu indywidualnym indywidualnie, więc współczynniki ekstynkcji są równe jeden dla każdej zasady.

Base
A	C	G	T
15,400	7,400	11,500	8,700

Zważywszy, że długość ścieżki w kuwecie wynosi 1,0 cm, wszystkie dane wejściowe do prawa Beera-Lamberta są teraz uwzględnione, a zatem równanie można przekształcić w celu obliczenia stężenia danego oligonukleotydu.

Aby obliczyć stężenie, prawo Beera-Lamberta jest przekształcane w następujący sposób:

Przykład: Obliczenia dla 5'-ACGT-3'

Krok pierwszy: obliczenie współczynnika ekstynkcji

��₂₆₀ = (AC+CG+GT)-(C+G) L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

��₂₆₀ = (21 200+18 000+20 000)-(7 400+11 500) L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

��₂₆₀ = 40,300 L ⋅ mol^-1 ⋅ cm^-1

Na wszystkich wyświetlaczach technicznych online i w dokumentacji drukowanej powyższa wartość 40 300 będzie wyświetlana jako 40.3. Wynika to z faktu, że jednostkami są L ⋅ mmol^-1 ⋅ cm^-1  (milimole zamiast moli).

Krok drugi: obliczenie stężenia

A₂₆₀ jest ustawione na 1,0 jednostkę gęstości optycznej (OD)

.

Krok trzeci: obliczenie masy molowej (MM)

Normalnie "masa cząsteczkowa" jest używana zamiast "masy molowej", ale ponieważ jednostki masy mola są potrzebne do tych obliczeń, "masa molowa" jest najbardziej poprawnym terminem. Ponadto, w celu uproszczenia wyświetlania, powyższe masy molowe każdej zasady zostały zaokrąglone do najbliższej liczby całkowitej. Dlatego obliczona wartość 1,170 jest nieco niższa od rzeczywistej wartości 1,173.83.

Krok czwarty: przeliczenie stężenia na jednostki zwyczajowe

Dlatego dla tej konkretnej sekwencji: 5'-ACGT-3', 1 OD = 29,0 µg mL^-1  (jeden OD to ilość oligonukleotydu w 1 mL roztworu, która wykazuje wartość A₂₆₀ równą 1.0 przy długości ścieżki światła 1,0 cm). Dla porównania, oto wartość określona przez OligoEvaluator™, nasz internetowy kalkulator sekwencji oligonukleotydów:

Istnieje doskonała zgodność między ręcznie obliczoną wartością 29,0 a obliczoną przez OligoEvaluator wartością 29,1 (rozbieżność wynika z faktu, że w obliczeniach ręcznych zastosowano zaokrąglone masy molowe każdej zasady, jak wyjaśniono powyżej w kroku trzecim).

Oprócz OligoEvaluator, 29.1 jest wartością, która byłaby wyświetlana w arkuszu danych technicznych dostarczonym z tym oligonukleotydem.

Skrótowe obliczenia dla 5'-ACGT-3'

Powyższe kroki obliczeniowe są żmudne. Poniższy wzór łączy wszystkie kroki w jeden i dlatego może być używany jako skrót:

 

Modyfikacje

Jedyną różnicą między obliczaniem stężenia dla standardowego i zmodyfikowanego oligonukleotydu jest to, że masa molowa modyfikacji jest brana pod uwagę i dodawana do całkowitej masy molowej oligonukleotydu. Na przykład, jeśli nasza powyższa sekwencja:

●     5'-ACGT-3'

zostanie zmieniona na

●     5'-6-FAM™-ACGT-3'

oraz nową masę molową 1,711.3 g mol^-1 jest wprowadzana do obliczeń długiego formularza lub wzoru skrótu, nowe stężenie wynosi

Wartość ta dobrze zgadza się z wartością określoną przez OligoEvaluator:

Szybkie konwersje

Zasadniczo, eksperymenty potwierdziły następujące szybkie konwersje (ds = podwójna nić; ss = pojedyncza nić):

●     A₂₆₀ dsDNA = 50 µg mL^-1
●     A₂₆₀ ssDNA = 37 µg mL^-1
●     A₂₆₀ ssRNA = 40 µg mL^-1

Bez wykonywania jakichkolwiek obliczeń, te współczynniki konwersji zapewniają rozsądne szacunki dla dłuższych sekwencji z bardziej równomiernym rozkładem zasad A, C, G i T, takich jak te powstałe w wyniku ścinania genomowego DNA (dla oszacowania dsDNA). Jednak w przypadku oligonukleotydów skład zasad jest bardziej prawdopodobny, a zatem szacunki te są niewiarygodne (często zawyżają stężenie). Stężenie należy określić dla każdego oligonukleotydu, jak opisano powyżej, stosując obliczenia w długim lub skróconym formularzu. Do weryfikacji wartości kwantyfikacji dostarczonych z technicznymi arkuszami danych można użyć zarówno obliczeń długiego formularza, jak i obliczeń skrótu.