Ręczne oczyszczanie białek znakowanych histydyną przy użyciu kolumn His GraviTrap™ TALON^®

Kolumny GraviTrap™ TALON^® są zapakowane w 1 ml pożywki TALON^® Superflow. Każda kolumna zapewnia proste ręczne oczyszczanie do 15 mg białek znakowanych histydyną. Różne etapy oczyszczania są wykonywane przy użyciu przepływu grawitacyjnego i nie wymagają dodatkowego sprzętu (Rysunek 1). Duże objętości próbek mogą być stosowane za jednym razem, a białko znakowane histydyną jest skutecznie eluowane w małej objętości. Każde opakowanie zawiera 10 wstępnie zapakowanych kolumn, a każda kolumna jest dostarczana w opakowaniu, które przekształca się w stojak na kolumny (Workmate). Plastikowa tacka w opakowaniu produktu może być używana do zbierania odpadów płynnych. Kolumny są wykonane z biokompatybilnego polipropylenu, a specjalne fryty w każdej kolumnie chronią medium przed wyschnięciem podczas oczyszczania. Odwiedź Charakterystyka produktów Ni Sepharose, Ni Sepharose excel, TALON^® Superflow i nienaładowanej IMAC Sepharose. 

Rysunek 1a. Jego kolumna GraviTrap™ TALON^® jest wstępnie zapakowaną kolumną grawitacyjno-przepływową do wygodnego ręcznego oczyszczania białek znakowanych histydyną.

Rysunek 1b. Schemat oczyszczania białek znakowanych histydyną na kolumnie His GraviTrap™ TALON^®.

Przygotowanie próbki i buforu

Ogólna procedura przygotowania próbki i buforu znajduje się w Oczyszczanie przy użyciu TALON^® Superflow wcześniej w tym rozdziale.

Purifikacja

Pojemność wiązania białka kolumny wynosi około 15 mg białka znakowanego histydyną/kolumnę (zależnie od białka). Podłączenie zbiornika LabMate (patrz Informacje o zamawianiu) do kolumny zwiększa wygodę podczas obsługi objętości powyżej 10 ml. Zwiększa to pojemność ładowania do około 35 ml w jednym przebiegu.

Przygotowanie i równowaga

1. Odetnij dolną końcówkę, zdejmij górną nasadkę, wylej nadmiar płynu i umieść kolumnę w statywie kolumnowym Workmate.
2. W razie potrzeby zamontuj LabMate na górze kolumny.
3. Kolumnę należy skalibrować za pomocą 10 ml buforu wiążącego. Fryty chronią kolumnę przed wyschnięciem podczas pracy.

Załaduj próbkę

1. Dodaj próbkę. Zaleca się objętość od 0,5 do 35 ml.

Po dokładnym rozbiciu komórek, możliwe jest zastosowanie niesklarowanej próbki bezpośrednio do kolumny bez doświadczania problemów z zatykaniem.

Płukanie

1. Płukać 10 ml buforu płuczącego.

Elucja

1. Nałożyć 3 ml buforu elucyjnego i zebrać eluat.
2. W warunkach denaturujących eluować 2 × 3 ml buforu elucyjnego.

Jeśli używasz buforów zawierających środki denaturujące lub lepkie roztwory, wykonaj oczyszczanie w temperaturze pokojowej.

Przykład zastosowania

Proste i szybkie oczyszczanie białek przy użyciu kolumn His GraviTrap™ TALON

.Kolumna His GraviTrap™ TALON^® umożliwia szybkie i łatwe ręczne oczyszczanie białek znakowanych histydyną bez konieczności stosowania systemu oczyszczania. Korzystając z protokołu przepływu grawitacyjnego, znakowane histydyną zielone białko fluorescencyjne (GFP-His) dodane do E. coli lizat został oczyszczony za pomocą kolumn His GraviTrap™ TALON^® w czasie krótszym niż 30 minut. Odzysk został obliczony przy użyciu pomiarów absorbancji i wyniósł 95%. Rysunek 3.43 przedstawia analizę SDS-PAGE pierwszej i drugiej frakcji elucyjnej. Wyniki wskazują na czystość ≥ 93% dla oczyszczonego białka GFP-His.

Rysunek 2. Analiza SDS-PAGE frakcji elucyjnych z oczyszczania GFP-His (Mr 28 000) dodanego do lizatu E. coli. Żel SDS-poliakryloamidowy (warunki redukujące) analizowano za pomocą oprogramowania ImageQuant TL. Eksperyment przeprowadzono w trzech powtórzeniach. Pierwsza frakcja elucyjna zawierała 96% oczyszczonego białka.