Odsalanie i wymiana buforów w chromatografii powinowactwa przeciwciał
Uwagi ogólne
Desalting w skali laboratoryjnej jest sprawdzoną, prostą i szybką metodą, która szybko usuwa zanieczyszczenia o niskiej masie cząsteczkowej, jednocześnie przenosząc próbkę do pożądanego buforu w jednym kroku.
Cytiva oferuje szereg gotowych kolumn chromatograficznych i 96-dołkowych płytek filtracyjnych, które mogą być używane ręcznie, razem z systemem chromatograficznym lub w aplikacjach o wysokiej wydajności (Tabela 2.8). Produkty te zawierają Sephadex™ G-25, podłoże do chromatografii wykluczania (SEC, znane również jako filtracja żelowa), które umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z przeciwciał o masie cząsteczkowej > 5000.
Używaj odsalania/wymiany bufora w razie potrzeby, przed i/lub pomiędzy etapami oczyszczania. Pamiętaj, że każdy dodatkowy krok może zmniejszyć wydajność i że odsalanie często rozcieńcza próbkę (protokoły wirowania nie rozcieńczają próbek).
Usuń sole i inne związki niskocząsteczkowe z białek o masie cząsteczkowej > 5000.
.Możliwe jest przetwarzanie próbek o objętości do 30% całkowitej objętości kolumny odsalającej. Wysoka prędkość i wydajność separacji pozwala na szybkie i efektywne przetwarzanie w laboratorium nawet stosunkowo dużych objętości próbek. Stężenie próbki nie ma wpływu na separację, o ile stężenie przeciwciał nie przekracza około 70 mg / ml przy użyciu normalnych buforów wodnych i pod warunkiem, że przeciwciało jest stabilne i rozpuszczalne w stosowanym stężeniu.
Gdy odsalanie jest pierwszym etapem chromatografii, próbkę należy najpierw sklarować; zaleca się wirowanie i/lub filtrację.
Użyj 100 mM octanu amonu lub 100 mM wodorowęglanu amonu, jeśli wymagane są lotne bufory.
Desalting zapewnia kilka korzyści w porównaniu z dializą, która jest ogólnie powolną techniką wymagającą dużych objętości buforu i niesie ze sobą ryzyko utraty materiału podczas przenoszenia.
W skali laboratoryjnej etap wymiany buforu i odsalania można pominąć, gdy próbki są dość czyste po filtracji lub odwirowaniu. W przypadku AC lub IEX wystarczające może być dostosowanie pH próbki i, jeśli to konieczne, siły jonowej próbki.
Wymiany buforu można czasem uniknąć poprzez rozcieńczenie w celu zmniejszenia siły jonowej, dodanie siarczanu amonu przed HIC lub miareczkowanie w celu dostosowania pH.
Odsalanie próbek na małą skalę
Dla próbek o objętości od 0.2 ml do 2,5 ml, możliwe jest równoległe przetwarzanie wielu próbek za pomocą kolumn odsalających PD-10, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25. Dla tych kolumn grawitacyjnych dostępne są dwa różne protokoły: jeden do użytku ręcznego na stanowisku laboratoryjnym; oraz jeden do użytku wraz ze standardową wirówką w połączeniu z adapterem Spin.
W przypadku mniejszych objętości próbek w zakresie od 100 do 180 µL, wiele próbek można uruchomić na kolumnach wirujących PD SpinTrap™ G-25 wraz z mikrowirówką lub 96-dołkową płytką PD MultiTrap™ G-25 przy użyciu wirowania do ekstrakcji (Rysunek 2.2).
Rysunek 2.2.(A) Przygotowanie próbki PD SpinTrap™ G-25. (B) Zautomatyzowane przygotowanie próbki PD MultiTrap™ G-25 w systemie zrobotyzowanym. (C i D) Spin Adaptery są używane razem z kolumnami odsalającymi PD-10, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25 w standardowej wirówce.
Odsalanie większych objętości próbek przy użyciu kolumn HiTrap® i HiPrep™
.Połącz szeregowo do trzech kolumn odsalających HiTrap®, aby zwiększyć pojemność próbki, na przykład dwie kolumny pozwalają na uzyskanie objętości próbki 3 ml; trzy kolumny pozwalają na uzyskanie objętości próbki 4,5 ml (Trap
).5 ml (Tabela 2.8).Podłącz do czterech kolumn odsalających HiPrep™ 26/10 szeregowo, aby zwiększyć objętość próbki, na przykład dwie kolumny pozwalają na próbkę o objętości 30 ml; cztery kolumny pozwalają na próbkę o objętości 60 ml. Nawet w przypadku czterech kolumn połączonych szeregowo, próbkę można przetworzyć w ciągu 20 do 30 minut (Tabela 2.8).
Przygotowanie buforu
Dla substancji zawierających grupy naładowane zaleca się stosowanie eluentu zawierającego sól buforową. Zaleca się stężenie soli wynoszące co najmniej 150 mM, aby zapobiec możliwym interakcjom jonowym z medium. W tym celu często stosuje się chlorek sodu. Często wystarczający jest bufor o stężeniu 25 do 50 mM substancji buforującej.
Przy stężeniach soli powyżej 1 M, substancje hydrofobowe mogą być opóźnione lub wiązać się z medium. Przy jeszcze wyższych stężeniach soli (> 1,5 M siarczanu amonu), wypełnienie kolumny kurczy się.
Przygotowanie próbki
Stężenie próbki nie ma wpływu na separację, o ile lepkość nie różni się o więcej niż współczynnik 1,5 od zastosowanego buforu. Odpowiada to maksymalnemu stężeniu 70 mg/ml dla białek, gdy stosowane są normalne, wodne bufory.
Próbka powinna być w pełni rozpuszczona. Odwiruj lub przefiltruj (filtr 0,45 µM) bezpośrednio przed załadowaniem, aby usunąć cząstki stałe, jeśli to konieczne.
Rozpuszczalność białka często zależy od pH i/lub siły jonowej (stężenia soli), a wymiana buforu może zatem spowodować wytrącenie białka. Ponadto aktywność białka może zostać utracona, jeśli zmiana pH wykracza poza zakres, w którym białko jest aktywne.
Protokoły w poniższych sekcjach opisują odsalanie i wymianę buforu przy użyciu różnych formatów wstępnie zapakowanych kolumn.
Ręczne odsalanie za pomocą kolumn HiTrap®
Rysunek 2.3.Kolumna odsalająca HiTrap® umożliwia wydajne, łatwe do przeprowadzenia rozdzielanie grup za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego.
HiTrap® Desalting to kolumna o pojemności 5 ml (Rysunek 2.3) wypełniona wypróbowanym i przetestowanym podłożem SEC, Sephadex™ G-25 Superfine. Medium oparte jest na usieciowanych kulkach dekstranowych, które zapewniają doskonałą rozdzielczość i wysoką szybkość przepływu. Zakres frakcjonowania białek globularnych wynosi od Mr 1 000 do 5 000, z granicą wykluczenia około Mr 5 000. Zapewnia to grupowe oddzielanie białek/peptydów większych niż Mr 5 000 od cząsteczek o masie cząsteczkowej mniejszej niż Mr 1 000.
HiTrap® Desalting może być stosowany z roztworami wodnymi w zakresie pH od 2 do 13. Zapakowany nośnik jest stabilny we wszystkich powszechnie stosowanych buforach, roztworach mocznika (8 M), chlorowodorku guanidyny (6 M) oraz wszystkich niejonowych i jonowych detergentach. Niższe alkohole (metanol, etanol, propanol) mogą być stosowane w buforze lub próbce, ale zalecamy, aby ich stężenie nie przekraczało 25% v/v. Należy unikać długotrwałej ekspozycji (godziny) na pH poniżej 2 lub powyżej 13 lub na środki utleniające.
Zalecany zakres objętości próbek wynosi od 0,1 do 1,5 ml, gdy pożądane jest całkowite usunięcie składników o niskiej masie cząsteczkowej. Szybkość przepływu w zakresie od 1 do 10 ml/min nie ma wpływu na separację. Maksymalna zalecana szybkość przepływu wynosi 15 ml/min. Separacje można łatwo przeprowadzić za pomocą strzykawki, pompy lub systemu chromatograficznego. Maksymalnie trzy kolumny mogą być połączone szeregowo, co pozwala na obsługę większych objętości próbek.
Rysunek 2.4 przedstawia typową separację odsalania i wymiany buforu uzyskaną przy użyciu HiTrap® Desalting i monitorowaną poprzez śledzenie zmian absorpcji UV i przewodności.
Rysunek 2.4.Wysoce wydajne odsalanie w 30 s przy użyciu HiTrap® Desalting.
Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, używaj kolumny tylko z tym samym typem próbki.
Równoważenie kolumny
- Napełnij strzykawkę lub rurkę pompy buforem. Zdejmij zatyczkę. Aby uniknąć wprowadzenia powietrza do kolumny, podłącz kolumnę "kropla w kroplę" do strzykawki (przez złącze) lub do rurki pompy.
- Usuń zatrzask na wylocie kolumny.
- Przepłucz kolumnę 25 ml buforu z prędkością 5 ml/min, aby całkowicie usunąć bufor do przechowywania, który zawiera 20% etanolu*. Jeśli w kolumnie uwięzione jest powietrze, należy przemywać ją odgazowanym buforem, aż powietrze zniknie. Powietrze wprowadzone do kolumny przypadkowo podczas aplikacji próbki nie ma wpływu na separację.
* 5 mL/min odpowiada około 120 kroplom/min przy użyciu kolumny HiTrap® 5 mL.
Ręczne odsalanie za pomocą strzykawki
- Aby obsługiwać kolumnę za pomocą strzykawki, podłącz strzykawkę do kolumny za pomocą dostarczonego złącza.
- Wyrównać kolumnę, patrz poprzednia strona Równoważenie kolumny.
- Nałożyć próbkę za pomocą strzykawki o pojemności od 2 do 5 ml z szybkością przepływu od 1 do 10 ml/min. Wyrzucić ciecz eluowaną z kolumny. Jeśli objętość próbki jest mniejsza niż 1,5 ml, zmień bufor i kontynuuj wstrzykiwanie, aż do wymycia łącznie 1,5 ml. Wyrzucić eluowaną ciecz.
- Odsolić białko odpowiednią objętością wybraną z Tabeli 2.9. Zbierz odsolone białko.
Maksymalna zalecana objętość próbki przy użyciu jednej kolumny HiTrap® Desalting 5 mL wynosi 1,5 mL, Tabela 2.9. Tabela 2.8 zawiera informacje na temat stosowania mniejszych objętości próbek.
Pusta objętość kolumny wynosi 1,5 ml. Składniki o wysokiej masie cząsteczkowej eluują między 1,5 a 4,5 ml, w zależności od objętości próbki. Składniki o niskiej masie cząsteczkowej zaczynają eluować po 3,5 ml.
Niektóre rodzaje cząsteczek, takie jak małe heterocykliczne lub homocykliczne związki aromatyczne (puryny, pirymidyny, barwniki) mogą wchodzić w interakcje z Sephadex™ i dlatego są eluowane później niż oczekiwano. W takich przypadkach można użyć większych objętości próbek, ale separacja musi być zoptymalizowana dla każdego rodzaju zanieczyszczającego związku.
Desalting przy użyciu pompy
- Wyrównaj kolumnę: patrz Wyrównywanie kolumny na poprzedniej stronie.
- Nałóż do 1,5 ml próbki. Monitoruj płyn z kolumny za pomocą monitora UV i/lub monitora przewodności. Utrzymuj szybkość przepływu w zakresie od 1 do 10 ml/min. Zebrać frakcje.
- Rozcieńczyć kolumnę około 10 ml buforu przed zastosowaniem następnej próbki. Zebrać frakcje.
Automatyzowane odsalanie za pomocą kolumn odsalających HiTrap® na ÄKTAprime plus
ÄKTAprime plus zawiera wstępnie zaprogramowane szablony dla poszczególnych kolumn HiTrap® Desalting i HiPrep™ Desalting 26/10. Poniższa procedura wykorzystuje kolumnę HiTrap® Desalting 5 mL.
Przygotowanie buforu
Bufor wyrównawczy (port A1): Przygotować co najmniej 500 mL wymaganego buforu
Woda i chemikalia używane do przygotowania buforu powinny być wysokiej czystości. Przed użyciem przefiltruj bufory przez filtr 0,45 µM.
Przygotowanie próbki
Przefiltruj próbkę przez filtr 0,45 µM.
Maksymalna zalecana objętość próbki wynosi 1.5 ml.
Przygotowanie ÄKTAprime plus
- Ułóż rurkę wlotową z portu A (zawór portu) i portu B (zawór 2-portowy) w buforze.
- Umieść trzy brązowe rurki odpadowe w zbiorniku odpadów.
- Podłącz kolumnę między portem 1 na zaworze wtryskowym (zawór 7-portowy) a komorą przepływową UV.
- Wypełnij stojak kolektora frakcji probówkami 18 mm (minimum 20) i umieść białą płytkę na ramieniu frakcjonującym względem pierwszej probówki.
- Podłącz pętlę próbki wystarczająco dużą dla próbki między portami 2 i 6 na zaworze wtryskowym. Użyj strzykawki do ręcznego napełnienia pętli.
Uwaga: Jeśli potrzebna jest pętla Superloop™, dodatkowe informacje znajdują się w instrukcji obsługi.Wprowadź objętość próbki i naciśnij OK, aby uruchomić szablon.
Po przygotowaniu systemu pozostałe kroki (w sekcji Wybór szablonu aplikacji i uruchomienie metody poniżej) zostaną wykonane automatycznie.
Wybór szablonu aplikacji i uruchomienie metody
- Sprawdź komunikację z PrimeView™. W prawym dolnym rogu ekranu powinien zostać wyświetlony tekst Controlled By: prime.
- Użyj przycisków strzałka i OK do nawigacji w menu. aby nawigować w drzewie menu, aż do znalezienia opcji Desalting HiTrap® Desalting.
3. Wprowadź objętość próbki i naciśnij OK aby uruchomić szablon.
Rysunek 2.5 przedstawia typowy wynik odsalania białka globularnego o normalnej wielkości przy użyciu kolumny odsalającej HiTrap® i systemu chromatograficznego ÄKTAprime plus. Wyniku pokazanego na tym rysunku można by również oczekiwać w przypadku wymiany buforowej przeciwciał. Ślady UV i przewodnictwa umożliwiają łączenie odpowiednich odsolonych frakcji.
Rysunek 2.5.Typowe odsalanie białka globularnego o normalnej wielkości przy użyciu systemu chromatograficznego.
Skalowanie odsalania z HiTrap® do HiPrep™
Dla rozdzielania próbek o objętości większej niż 1,5 ml lub w celu zwiększenia rozdzielczości między składnikami o wysokiej masie cząsteczkowej.5 ml lub w celu zwiększenia rozdzielczości między składnikami o wysokiej i niskiej masie cząsteczkowej, można łatwo połączyć szeregowo do trzech kolumn odsalających HiTrap® (Tabela 2.8). W przypadku operacji strzykawkowych objętości sugerowane w Tabeli 2.8 powinny być proporcjonalnie zwiększone, a zalecana szybkość przepływu utrzymana. Rozcieńczenie próbki zależy od objętości próbki i liczby kolumn używanych szeregowo. Można uzyskać niższe współczynniki rozcieńczenia niż proponowane w Tabeli 2.8 ale objętości elucji muszą być zoptymalizowane dla każdej kombinacji objętości próbki i liczby kolumn w szeregu. Ciśnienie wsteczne dla każdej kolumny wynosi około 0,25 bara przy 10 ml/min.
HiPrep™ 26/10 Desalting jest wypełniony Sephadex™ G-25 Fine. Zapewnia grupowe oddzielanie substancji o wysokiej (Mr > 5 000) od substancji o niskiej masie cząsteczkowej (Mr < 1 000), umożliwiając niezawodne i powtarzalne odsalanie i wymianę buforu przy wielkości próbki 15 ml na kolumnę. Od dwóch do czterech kolumn może być używanych szeregowo (Tabela 2.8) dla próbek o objętości od 30 do 60 ml (Rysunek 2.6).
Rysunek 2.6.Próbka o objętości 60 ml może być przetwarzana na czterech kolumnach odsalających HiPrep™ 26/10 połączonych szeregowo.
Automatyczna wymiana buforu w urządzeniu HiPrep™ 26/10 Desalting z ÄKTAprime plus
Przygotowanie buforu
Bufor wyrównawczy (port A1): 20 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7.0. Przygotować co najmniej 500 ml eluentu
Przygotowanie próbki
Woda i chemikalia używane do przygotowania buforu powinny być wysokiej czystości. Przed użyciem należy przefiltrować bufory przez filtr 0,45 µm.
Przepuścić próbkę przez filtr 0,45 µm.
Maksymalna zalecana objętość próbki wynosi 15 ml.
- Umieść rurki wlotowe z portu A (zawór 8-portowy) i portu B (zawór 2-portowy) w buforze.
- Umieść trzy brązowe rurki odpływowe w kolbie odpływowej.
- Podłącz kolumnę między portem 1 na zaworze wtryskowym (zawór 7-portowy) a komorą przepływową UV.
- Napełnij stojak kolektora frakcji probówkami 18 mm (minimum 25) i umieść białą płytkę na ramieniu frakcjonującym względem pierwszej probówki.
- Podłącz pętlę próbki wystarczająco dużą dla próbki między portami 2 i 6 na zaworze wtryskowym. Użyj strzykawki do ręcznego napełnienia pętli.
Uwaga: Jeśli potrzebna jest pętla Superloop, dodatkowe informacje znajdują się w instrukcji obsługi produktu.
Po przygotowaniu systemu pozostałe kroki (w sekcji Wybór szablonu aplikacji i uruchomienie opisanej wcześniej metody) zostaną wykonane automatycznie.
Wybór szablonu aplikacji i uruchomienie metody
- Sprawdź komunikację z PrimeView. W prawym dolnym rogu ekranu powinien zostać wyświetlony tekst Controlled By: prime.
- Użyj przycisków strzałka i OK, aby poruszać się po drzewie menu, aż znajdziesz D>.Desalting HiPrep™ Desalting.
3. Wprowadź objętość próbki i naciśnij OK aby uruchomić szablon.
Rysunek 2.7.Typowe odsalanie BSA przy użyciu systemu chromatograficznego.
Odsalanie na małą skalę i wymiana buforu za pomocą kolumn odsalających PD
Kolumny odsalające PD-10, kolumny PD MidiTrap™ G-25, PD MiniTrap™ G-25, PD SpinTrap™ G-25 i PD MultiTrap™ G-25 oraz 96-dołkowe płytki fi ltracyjne PD-10 są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex™ G-25.są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex™ G-25 do grupowego oddzielania substancji o wysokiej (Mr > 5 000) i niskiej masie cząsteczkowej (Mr < 1 000) poprzez odsalanie i wymianę buforu.
Produkty PD zaspokajają potrzebę elastycznego przygotowania na małą skalę próbki białka lub innych biomolekuł przed dalszymi technikami analitycznymi, takimi jak elektroforeza żelowa, chromatografia cieczowa (LC), chromatografia cieczowa-spektrometria mas (LC-MS) i spektrometria mas (MS). Ta kolekcja kolumn i płytek obejmuje zakres objętości próbek od 70 µL do 2,5 ml i umożliwia równoległe przetwarzanie wielu próbek. Kolumny odsalające PD-10, PD MidiTrap™ G-25 i PD MiniTrap™ G-25 są również zoptymalizowane pod kątem wirowania, co nie powoduje rozcieńczania eluowanej próbki.
PD SpinTrap™ G-25
Rysunek 2.8.Kolumny PD SpinTrap™ G-25 to kolumny jednorazowego użytku do szybkiego odsalania i wymiany buforu biomolekuł o masie cząsteczkowej > 5000.
PD SpinTrap™ G-25 to kolumna wirówkowa jednorazowego użytku, która została zaprojektowana do szybkiego, wysoce powtarzalnego odsalania i wymiany buforu od 100 do 180 µL próbki przy użyciu standardowej mikrowirówki (Rysunki 2.2 A i 2.8). Kolumny zapewniają wysoce powtarzalne, równoległe odsalanie/wymianę buforu i oczyszczanie próbek białek bez ich rozcieńczania.
Każde opakowanie PD SpinTrap™ G-25 zawiera wstępnie zapakowane kolumny i probówki na 50 preparatów.
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zawiesić pożywkę przez worteksowanie. Odkręć zakrętkę i zdejmij dolne zamknięcie za pomocą plastikowego narzędzia do zdejmowania dolnej zakrętki.
2. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej o odpowiednim rozmiarze i usunąć roztwór magazynujący przez wirowanie przez 1 min przy 800 × g.
3. Wyrównać, dodając 400 µl buforu wyrównawczego i wirować przez 1 min przy 800 × g. Odrzucić przepływający roztwór i wymienić probówkę zbierającą. Powtórzyć tę procedurę cztery razy.
Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe znaczenie ma wyrównanie kolumny wirówkowej za pomocą 1,5 ml buforu wyrównującego w celu całkowitego usunięcia roztworu do przechowywania.
4. Wymienić zużytą probówkę na nową czystą probówkę do pobierania próbek.
5. Powoli nanieść od 100 do 180 µL próbki na środek wstępnie zapakowanej kolumny.
6. Elucja przez wirowanie z prędkością 800 x g przez 2 min.
Do odsalania większych objętości próbek należy użyć produktów czyszczących PD o większej skali lub kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8. Do odsalania wielu próbek należy użyć PD MultiTrap™ G-25.
Odzysk zależy od rodzaju białka lub innej biomolekuły. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk można poprawić dla objętości próbki mniejszej niż 140 µL, dodając 40 µL buforu wyrównawczego po całkowitym wchłonięciu próbki przez złoże kolumny.
PD MultiTrap™ G-25
Rysunek 2.9.96-dołkowe płytki PD MultiTrap™ G-25 oferują szybkie, wysoce powtarzalne oczyszczanie biomolekuł o masie cząsteczkowej > 5000.
Płytki 96-dołkowe PD MultiTrap™ G-25 są przeznaczone do wysokowydajnego odsalania, wymiany buforu i oczyszczania białek, z wysoką powtarzalnością od dołka do dołka i od płytki do płytki (rysunek 2.9). Korzystając z 96-dołkowych płytek, można wygodnie i powtarzalnie przeprowadzać równolegle wiele próbek (rysunek 2.10). PD MultiTrap™ G-25 może być obsługiwany ręcznie lub w trybie automatycznym przy użyciu systemu zrobotyzowanego wraz z wirówką do odsalania lub wymiany buforu próbek o objętości od 70 do 130 µL.
Studzienki są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex™ G-25, pożywkę SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z biomolekuł o masie cząsteczkowej > 5000.
Każde opakowanie PD MultiTrap™ G-25 zawiera cztery wstępnie zapakowane 96-studzienkowe płytki, umożliwiające odsalanie lub wymianę buforu do 384 próbek. Wygodne płytki zbiorcze (pięć w opakowaniu) są dostępne osobno.
Rysunek 2.10.Usuwanie chlorku sodu z BSA na 96-dołkowej płytce PD MultiTrap™ G-25 wykazało wysoce powtarzalne wyniki. Średnia wydajność odsalania wyniosła 93%, a odchylenie między dołkami wyniosło 1% (względne odchylenie standardowe).
Protokół wirowania
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zawiesić pożywkę, delikatnie potrząsając płytką do góry dnem. Usunąć górne i dolne uszczelki i umieścić płytkę na płytce zbiorczej.
2. Usunąć roztwór do przechowywania przez wirowanie przez 1 min z prędkością 800 × g.
3. Wyrównać, dodając 300 µL buforu wyrównawczego na studzienkę. Wirować przez 1 min z prędkością 800 × g. Odrzucić przepływający roztwór i wymienić płytkę zbiorczą. Powtórzyć tę procedurę cztery razy.
Aby zapewnić optymalne wyniki, bardzo ważne jest wyrównanie każdej studzienki za pomocą 1,5 ml buforu wyrównującego w celu całkowitego usunięcia roztworu do przechowywania.
4. Wymienić zużytą płytkę zbiorczą na nową, czystą płytkę zbiorczą do pobierania próbek.
5. Nałożyć od 70 do 130 µl próbki na środek przygotowanych dołków.
6. Elucja przez wirowanie z prędkością 800 × g przez 2 minuty.
Do odsalania większych objętości próbek należy użyć produktów do oczyszczania PD o większej skali lub kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzyskiwanie zależy od rodzaju białka lub innej biomolekuły. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk można poprawić dla objętości próbki mniejszej niż 100 µL, dodając 30 µL buforu wyrównawczego po całkowitym wchłonięciu próbki przez złoże kolumny.
PD MiniTrap™ G-25
Rysunek 2.11.PD MiniTrap™ G-25 to wstępnie zapakowana kolumna do oczyszczania białek o masie cząsteczkowej > 5000 w próbkach o objętości do 500 µL.
PD MiniTrap™ G-25 jest przeznaczony do wygodnego odsalania i wymiany buforu próbki białka o objętości od 100 do 500 µL (rysunek 2.11). Kolumny są wstępnie wypełnione pożywką Sephadex™ G-25, pożywką SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o masie cząsteczkowej > 5000. Kolumny te stanowią doskonałą alternatywę dla kolumn PD SpinTrap™ G-25 ze względu na zwiększoną pojemność próbki.
W celu zwiększenia elastyczności, produkt ma dwa alternatywne protokoły aplikacji, wykorzystujące grawitację lub wirowanie. Protokół grawitacyjny umożliwia proste oczyszczanie wielu próbek równolegle bez potrzeby stosowania systemu oczyszczania. Dzięki protokołowi wirowania próbki są przeprowadzane w standardowej wirówce przy minimalnym rozcieńczeniu eluowanej próbki.
Każde opakowanie PD MiniTrap™ G-25 zawiera 50 wstępnie zapakowanych kolumn i cztery adaptery, które są wymagane podczas korzystania z protokołu wirowania.
Protokół grawitacyjny
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zdjąć górną nasadkę i wylać roztwór do przechowywania kolumny. Zdejmij dolną nasadkę.
2. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie dostał się do wypełnionego złoża.
Aby zapewnić optymalne wyniki, bardzo ważne jest, aby skalibrować kolumnę za pomocą łącznie 8 ml buforu do kalibracji, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
3. Dodaj od 100 do 500 µL próbki do kolumny. W przypadku próbek o objętości mniejszej niż 500 µL, dodać bufor wyrównawczy, aby dostosować objętość do 500 µL po całkowitym wprowadzeniu próbki do wypełnionego złoża.
4. Poczekać, aż próbka i bufor wyrównawczy całkowicie dostaną się do złoża upakowanego. Odrzucić przepływ.
5. Umieścić probówkę do pobierania próbek pod kolumną i eluować 1 ml buforu.
Do odsalania większych objętości próbek należy użyć kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.
Typowy wynik odsalania białka pokazano na Rysunku 2.12. Chociaż odsolone białko pokazane na rysunku to BSA, podobnego wyniku można oczekiwać w przypadku odsalania przeciwciał przy użyciu PD MiniTrap™ G-25.
Rysunek 2.12.Usuwanie chlorku sodu z BSA przy użyciu protokołu grawitacyjnego. Odzysk białka wyniósł 95%.
Protokół wirowania
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zdjąć górną pokrywkę i wylać roztwór do przechowywania kolumny.
2. Zdejmij górny filtr za pomocą kleszczyków. Zdejmij dolną pokrywę.
3. Umieść PD MiniTrap™ G-25 w probówce o pojemności 15 ml i podłącz dostarczony adapter kolumny do górnej części probówki.
4. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie przedostał się do wypełnionego złoża. Powtórzyć i odrzucić przepływ.
5. Ponownie napełnij kolumnę buforem do kalibracji i odwiruj przy 1000 x g przez 2 minuty, a następnie wyrzuć przepływający bufor.
Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe znaczenie ma kalibracja kolumny przy użyciu łącznie 8 ml buforu do kalibracji (kroki 4 i 5), aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
6. Dodaj powoli 200 do 500 µl próbki na środek wypełnionego złoża.
7. Umieść PD MiniTrap™ G-25 w nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
8. Eluuj przez wirowanie 1000 x g przez 2 min i zbierz eluat.
Do odsalania większych objętości próbek użyj kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.
PD MidiTrap™ G-25
Rysunek 2.13.PD MidiTrap™ G-25 to wstępnie zapakowana kolumna do oczyszczania białek o masie cząsteczkowej > 5000 w próbkach o objętości do 1 ml.
PD MidiTrap™ G-25 jest przeznaczony do wygodnego odsalania i wymiany buforu od 0,5 do 1,0 ml próbki białka (Rysunek 2.13). Kolumny są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex™ G-25, pożywkę SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o masie cząsteczkowej > 5000. Kolumny te stanowią doskonałą alternatywę dla kolumn PD MiniTrap™ G-25 ze względu na zwiększoną pojemność próbki.
W celu zwiększenia elastyczności, produkt ma dwa alternatywne protokoły aplikacji, wykorzystujące grawitację lub wirowanie. Protokół grawitacyjny umożliwia proste oczyszczanie wielu próbek równolegle bez potrzeby stosowania systemu oczyszczania. Dzięki protokołowi wirowania próbki są uruchamiane w standardowej wirówce przy minimalnym rozcieńczeniu eluowanej próbki.
Każde opakowanie PD MidiTrap™ G-25 zawiera 50 wstępnie zapakowanych kolumn i cztery adaptery, które są wymagane podczas korzystania z protokołu wirowania.
Protokół wirowania
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zdjąć górną pokrywkę i wylać roztwór do przechowywania kolumny.
2. Zdejmij górny filtr za pomocą kleszczyków. Zdejmij dolną pokrywę.
3. Umieść PD MidiTrap™ G-25 w probówce zbiorczej o pojemności 50 ml i podłącz dostarczony adapter kolumny do górnej części probówki.
4. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie przedostał się do wypełnionego złoża. Powtórzyć i odrzucić przepływ.
5. Ponownie napełnić kolumnę buforem do kalibracji i wirować przy 1000 x g przez 2 minuty, a następnie odrzucić przepływający bufor.
Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest kalibrowanie kolumny przy użyciu łącznie 15 ml buforu do kalibracji (kroki 4 i 5), aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
6. Dodaj powoli 0,75 do 1,0 ml próbki do środka wypełnionego złoża.
7. Umieścić PD MidiTrap™ G-25 w nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml.
8. Eluuj przez wirowanie 1000 x g przez 2 min i zbierz eluat.
Do odsalania większych objętości próbek użyj kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.
Jednorazowe kolumny odsalające PD-10
Kolumny odsalające PD-10 są przeznaczone do wygodnego odsalania i wymiany buforu próbki białka o objętości od 1,0 do 2,5 ml. Kolumny są wstępnie zapakowane w pożywkę Sephadex™ G-25, pożywkę SEC, która umożliwia skuteczne usuwanie substancji o niskiej masie cząsteczkowej z białek o masie cząsteczkowej > 5000. Kolumny te stanowią doskonałą alternatywę dla kolumn PD MidiTrap™ G-25 ze względu na zwiększoną pojemność próbki.
W celu zwiększenia elastyczności, produkt ma dwa alternatywne protokoły aplikacji, wykorzystujące grawitację lub wirowanie. Protokół grawitacyjny umożliwia proste oczyszczanie wielu próbek równolegle bez potrzeby stosowania systemu oczyszczania. Korzystając z protokołu wirowania, próbki są uruchamiane w standardowej wirówce przy minimalnym rozcieńczeniu eluowanej próbki.
Każde opakowanie kolumn odsalających PD-10 zawiera 30 wstępnie zapakowanych kolumn. Aby uprościć korzystanie z kolumn odsalających PD-10 z protokołem grawitacyjnym, można użyć zbiornika buforowego LabMate PD-10. Korzystając ze zbiornika buforowego, bufory do przemywania i wyrównywania można zastosować w jednym kroku.
Typowy rozdział przedstawiono na Rysunku 2.14. Chociaż rysunek przedstawia typowe odsalanie albuminy, byłby to oczekiwany wynik odsalania przeciwciał.
Rysunek 2.14.Usuwanie chlorku sodu z roztworu albuminy. Kolumna odsalająca PD-10 została zrównoważona wodą destylowaną. Próbka zawierała albuminę surowicy ludzkiej (25 mg) rozpuszczoną w 2,5 ml 500 mM roztworu chlorku sodu. Łącznie 23,8 mg albuminy odzyskano w 3,5 ml eluentu, co odpowiada wydajności 95,3% (między strzałkami). Początkowa całkowita zawartość soli w próbce przed odsalaniem wynosiła 2%.
Protokół grawitacyjny
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
- Odetnij dolną końcówkę, zdejmij górną nasadkę i wylej nadmiar płynu.
- Jeśli jest dostępny, zamontuj zbiornik buforowy LabMate na górze kolumny odsalającej PD-10 i umieść kolumny w PD-10 Desalting Workmate.
- Wyrównaj kolumnę za pomocą około 25 ml buforu. Odrzuć wypływ (użyj plastikowej tacy do zebrania wypływu).
Aby zapewnić optymalne wyniki, krytyczne jest wyrównanie kolumny za pomocą 25 ml buforu wyrównującego, aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
- Dodaj próbkę o całkowitej objętości 2,5 ml. Jeśli próbka jest mniejsza niż 2,5 ml, dodaj bufor, aż do uzyskania całkowitej objętości 2,5 ml. Odrzuć wypływ.
- Rozcieńczyć 3,5 ml buforu i zebrać wypływ.
Do odsalania większych objętości próbek należy użyć kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzysk zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk i zdolność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.
Protokół wirowania
Bufor
Bufor wyrównawczy: Odpowiedni do zastosowania
Procedura usuwania soli
1. Zdjąć górną pokrywkę i wylać roztwór do przechowywania kolumny.
2. Zdejmij górny filtr za pomocą kleszczyków. Zdjąć dolną pokrywę.
3. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w probówce o pojemności 50 ml i podłącz dostarczony adapter kolumny do górnej części probówki.
4. Napełnij kolumnę buforem wyrównawczym i pozwól, aby bufor wyrównawczy całkowicie przedostał się do wypełnionego złoża. Powtórzyć trzykrotnie, za każdym razem odrzucając przepływ.
5. Ponownie napełnić kolumnę buforem wyrównawczym i odwirować przy 1000 x g przez 2 minuty, a następnie odrzucić przepływający bufor.
Aby zapewnić optymalne wyniki, kluczowe jest wyrównanie kolumny za pomocą łącznie 25 ml buforu wyrównawczego (kroki 4 i 5), aby całkowicie usunąć roztwór do przechowywania.
6. Dodaj powoli od 1,75 do 2,5 ml próbki na środek wypełnionego złoża.
7. Umieść kolumnę odsalającą PD-10 w nowej probówce zbiorczej o pojemności 50 ml.
8. Eluuj przez wirowanie 1000 x g przez 2 min i zbierz eluat.
Do odsalania większych objętości próbek użyj kolumn HiTrap® i HiPrep™, Tabela 2.8.
Odzyskiwanie zależy od rodzaju białka. Zazwyczaj odzysk mieści się w zakresie od 70% do 90%. Stężenie próbki może poprawić odzysk. Odzysk i wydajność odsalania są wyższe przy użyciu przepływu grawitacyjnego w porównaniu z wirowaniem.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?