Wprowadzenie do zatężania i wymiany buforu przy użyciu kadzi mieszających Amicon^®

• Products
• Jednoczesne zatężanie próbki i wymiana buforu przez ultrafiltrację i diafiltrację
• Jak wybrać odpowiednią membranę ultrafiltracyjną (NMWCO) dla próbki
• Diafiltracja w porównaniu do dializy
• Ciągła vs. Diafiltracja nieciągła
• Wymagania dotyczące bufora dla ciągłej diafiltracji

Przygotowanie próbek roztworów makrocząsteczek, takich jak białka, enzymy, przeciwciała i wirusy, często daje duże objętości rozcieńczonych makrozoli w buforach, które są niekompatybilne z dalszymi procesami lub wykrywaniem.

Odśrodkowe urządzenia do ultrafiltracji (takie jak Amicon^® Ultra Filters) są regularnie używane do zatężania i wymiany buforowej tego typu makrozoli; jednak objętości większe niż 50 ml stanowią poważne wyzwanie, wymagając ładowania próbek w wielu etapach lub podzielenia ich na kilka urządzeń.

Rodzina urządzeń do filtracji ciśnieniowej Amicon^® Stirred Cell stanowi idealne rozwiązanie do zatężania i wymiany buforowej dużych objętości makrozoli. Urządzenia te są dostępne w wielu rozmiarach, aby zapewnić szeroki zakres przetwarzanych objętości. Aby przetwarzać jeszcze większe objętości, do każdej komory Amicon^® Stirred Cell można podłączyć zewnętrzny zbiornik.Nowa generacja komór Amicon^® Stirred Cells zapewnia korzyści ergonomiczne, zintegrowane funkcje bezpieczeństwa, bezpieczniejsze mieszadło, doskonałą integralność i łatwość użytkowania, zapewniając jednocześnie szerszy wybór dysków membranowych.

Zobacz, jak ulepszona konstrukcja ogniw mieszających Amicon^® umożliwia bezpieczniejszy montaż, lepszą integralność urządzenia i tę samą niezrównaną wydajność.

Simultaneous Sample Concentration and Buffer Exchange by Ultrafiltration Plus Diafiltration

Ultrafiltracja to sprawdzona metoda zatężania próbek. W połączeniu z diafiltracją, interesujący analit jest dostarczany w stężeniu i buforze, który jest kompatybilny z dodatkowymi etapami oczyszczania i analizy. Podczas ultrafiltracji uzyskuje się pożądane stężenie makrocząsteczek, ponieważ stężenie gatunków nieprzepuszczalnych wzrasta przy jednoczesnym zmniejszeniu objętości płynu. Co więcej, stężenie gatunków przepuszczających błonę, takich jak sole i mikrozole, pozostaje niezmienione.

Jak wybrać właściwą membranę ultrafiltracyjną (NMWCO) dla próbki

Przy stosowaniu ultrafiltracji do zatężania próbek, szczególną uwagę należy zwrócić na wybór właściwej masy cząsteczkowej membrany, a także materiału membrany. Membrany ultrafiltracyjne są zazwyczaj wykonane z regenerowanej celulozy lub polieterosulfonu (PES). Wybór materiału zależy w dużej mierze od kompatybilności próbki. Wybór nominalnej masy cząsteczkowej membrany (NMWCO) będzie zależeć od masy cząsteczkowej (MW) makrocząsteczki, która ma zostać zatrzymana. Wybór membrany będzie miał znaczący wpływ na wydajność. Zasadniczo NMWCO powinno być 2-3 razy mniejsze niż masa cząsteczkowa substancji rozpuszczonej, która ma być zatrzymywana przy użyciu regenerowanej celulozy i 4-5 razy mniejsze dla membran Biomax^® PES.

Na retencję substancji rozpuszczonej może dodatkowo wpływać:

• Temperatura przetwarzania
• Ciśnienie robocze
• Prędkość mieszania
• Stężenie próbki 
Stężenie próbki
• Skład próbki

Potrzebna może być optymalizacja powyższych parametrów w celu zapewnienia pożądanej wydajności. Najczęściej stosowane membrany ultrafiltracyjne mają zakres NMWCO od 3 kDa do 100 kDa, chociaż dostępne są mniejsze i większe rozmiary porów.

Diafiltracja w porównaniu do dializy

Diafiltracja to technika wykorzystująca ultrafiltrację do wymiany buforu. Diafiltracja może szybko i skutecznie wyeliminować sole i/lub mikrozole z mieszanin makrocząsteczkowych. Proces ten jest zwykle nazywany "wymywaniem".

Termin "wymywanie" jest używany, gdy diafiltracja jest stosowana w celu zastąpienia jednego gatunku soli lub mikrozolu innym, jak ma to miejsce podczas wymiany buforu.

Tradycyjna dializa jest alternatywną techniką wymiany buforu; ma jednak kilka wad:

1. Polega na powolnej dyfuzji i trudnych w obsłudze rurkach dializacyjnych lub kasetach.
   
2. W wielu przypadkach, w trakcie dializy, objętość w rurce dializacyjnej wzrasta w wyniku osmozy, dodatkowo rozcieńczając próbkę i wymagając etapu zatężania próbki.
   
3. Dializa może wymagać dużych objętości buforu i wielokrotnych zmian buforu.

W przeciwieństwie do tego, diafiltracja wykorzystuje membrany ultrafiltracyjne, zarówno w urządzeniach odśrodkowych, jak i ciśnieniowych, takich jak Amicon^® Stirred Cell, do wydajnej wymiany buforu. 

Zalety diafiltracji przy użyciu ultrafiltracji z mieszaniem komórek:

1. W przeciwieństwie do rurek dializacyjnych, membrany ultrafiltracyjne mogą być używane zarówno do zatężania próbek, jak i wymiany buforu 
   
2. Minimalizuje transfer próbek i zmniejsza ich straty.
   
3. Diafiltracja często wymaga znacznie mniejszej objętości buforu niż tradycyjna dializa.

Diafiltracja	Dializa
Transport konwekcyjny z rozpuszczalnikami, niezależny od składu mikrozoli	Transport sterowany dyfuzją, zależny od rodzaju mikrozoli
Wymagana mniejsza objętość buforu wymiany	Wymagana duża objętość buforu wymiany, wydajne mieszanie i częste zmiany buforu wymagane do zapewnienia wydajnego transportu
Szybki kurs wymiany. Frakcyjne usuwanie mikrozoli rozpuszczalnika jest niezależne od składu próbki	Częstotliwość wymiany jest powolna, a wydajność zmniejsza się wraz ze spadkiem stężenia mikrozoli
Szybkość ultrafiltracji zmniejsza się wraz ze spadkiem temperatury	Zmniejszony transport mikrosolutu wraz ze spadkiem temperatury
Przy wysokiej zawartości makroskładników, szybkość ultrafiltracji i transport mikroskładników są zmniejszone	Na transport mikroskładników nie ma wpływu zawartość zatrzymanych makroskładników
Skalowalny; kompatybilny z próbkami o objętości od kilku mikrolitrów do wielu litrów	Niełatwo skalowalny do dużych objętości, najlepiej stosować go do próbek o objętości od mikrolitra do litra.

Diafiltracja ciągła a nieciągła

Diafiltracja może być wykonywana w trybie ciągłym lub nieciągłym. Diafiltracja nieciągła odnosi się do praktyki, w której próbka jest najpierw zatężana, a następnie rozcieńczana buforem wymiennym do początkowej objętości początkowej, po czym następuje kolejny etap zatężania. Proces ten jest powtarzany do momentu wymiany pożądanej ilości mikrosolutu.

Z drugiej strony, ciągła diafiltracja utrzymuje stałą objętość podczas całego procesu wymiany buforu, wprowadzając bufor wymiany z taką samą szybkością, z jaką usuwany jest filtrat. Utrzymując stałą objętość, zatrzymane stężenie substancji rozpuszczonej pozostaje stałe, zapewniając łagodniejszą metodę wymiany buforu.

Ogólnie rzecz biorąc, ciągła diafiltracja jest bardziej wydajna niż diafiltracja nieciągła. W przypadku diafiltracji nieciągłej strumień permeatu zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia próbki, co może przyczyniać się do zanieczyszczenia membrany i powodować zwiększoną retencję mikrozoli, które w przeciwnym razie przeszłyby przez membranę.

Porównanie między diafiltracją nieciągłą i ciągłą dla roztworu zawierającego zatrzymaną makrosolutę i przechodzącą mikrosolutę.

Obliczanie objętości wymiany buforu dla diafiltracji ciągłej

Zapotrzebowanie na bufor podczas diafiltracji jest zwykle wyrażane jako "objętość diafiltracji" (DV). DV jest równa objętości permeatu usuniętego podczas diafiltracji podzielonej przez objętość pozostałego retentatu (równanie 1).

Mikrozole, które są częściowo zatrzymywane przez membranę, będą wymagały dodatkowego DV. Zgodnie z ogólną zasadą, użycie DV = trzykrotności objętości próbki spowoduje wypłukanie 95%, a użycie DV = pięciokrotności objętości próbki spowoduje usunięcie 99% niezatrzymanej mikrosoluty.

Równanie 2 można wykorzystać do teoretycznych obliczeń wymagań dotyczących objętości diafiltracji. Są to jednak wytyczne, a rzeczywiste wymagania dotyczące objętości diafiltracji muszą być określone empirycznie.

Wymagania dotyczące bufora dla ciągłej diafiltracji

Dokładniejsza charakterystyka zarówno dla diafiltracji ciągłej typu wash-in, jak i wash-out. Rysunek przedstawia teoretyczne objętości diafiltracji dla mikrozoli przechodzących przez membranę (R=0), a także częściowo zatrzymanych mikrozoli (R=0,1, 0,2 itd.).

Obliczanie objętości wymiany buforu dla diafiltracji nieciągłej

W diafiltracji nieciągłej usuwanie soli i mikrozoli zależy od stopnia stężenia podczas powtarzanych etapów zatężania/rozcieńczania. Poziom mikrozoli zmniejsza się zgodnie z równaniem 3 podczas każdego etapu.

Przykład: 100 ml próbki białka albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 1 mg/ml zawierającej sól o stężeniu 1 M zatęża się do 50 ml, zatężając białko do 2 mg/ml, podczas gdy stężenie soli jest stałe i wynosi 1 M. Następnie próbkę rozcieńcza się z powrotem do 100 ml, zmniejszając stężenie BSA do 1 mg/ml i stężenie soli do 0,5 M. Każdy etap diafiltracji zmniejsza stężenie soli do 50%.5 M. Każdy etap diafiltracji zmniejsza stężenie soli o 50%.

Te dwa etapy są powtarzane, aż sól zostanie zredukowana do pożądanego stężenia.

Stężenie soli po każdym etapie można obliczyć za pomocą równań 3 i 4:

Stężenie soli po każdym etapie można obliczyć za pomocą równań 3 i 4.

Powyższe należy traktować jako wytyczne, ponieważ typy próbek i ich skład znacznie się różnią, a nadmierne stężenie może mieć szkodliwe konsekwencje.

Ciągła diafiltracja jest tradycyjnie stosowana z systemami filtracji z przepływem stycznym (TFF) o dużej objętości, można użyć tej delikatnej formy wymiany buforu z Amicon^® Stirred Cell.

Ten sam zbiornik używany do zwiększenia objętości przetwarzania podczas zatężania próbki może być teraz używany do buforu diafiltracyjnego. Po zastosowaniu i wyrównaniu ciśnienia w całym układzie, bufor wymienny będzie wchodził do mieszanej celi z taką samą szybkością, z jaką usuwany jest permeat.