Immobilizowana chromatografia powinowactwa chelatów metali (IMAC)

• Przykład oczyszczania
• Rozwój protokołu separacji
• Wybór jonu metalu
• Wybór bufora wiążącego
• .Wybór buforów elucyjnych
• Skala działania
• Czyszczenie
• Stabilność chemiczna
• Storage
• Related Products

Białka i peptydy, które mają powinowactwo do jonów metali, mogą być rozdzielane za pomocą chromatografii chelatowej. Metale są unieruchamiane na podłożu chromatograficznym poprzez chelatowanie. Niektóre aminokwasy, np. histydyna i cysteina, tworzą kompleksy z chelatowanymi metalami wokół neutralnego pH (pH 6-8) i to głównie zawartość histydyny w białku jest odpowiedzialna za jego wiązanie z chelatowanym metalem.

Chromatografia chelatowa metali jest doskonała do oczyszczania rekombinowanych (His)₆ białek fuzyjnych (strona 47, białek fuzyjnych Poly (His)), jak również wielu białek naturalnych. Chelating Sepharose™, podłoże stosowane do chromatografii chelatowej metali, jest tworzone przez sprzężenie ligandu tworzącego chelat metalu (kwas iminodioctowy) z Sepharose™.

Przed użyciem podłoże jest ładowane roztworem dwuwartościowych jonów metali, takich jak Ni²⁺, Zn²⁺, Cu²⁺, Ca²⁺, Co²⁺ lub Fe²⁺. Reakcja wiązania z białkiem docelowym jest zależna od pH, a związana próbka jest najczęściej wymywana przez zmniejszenie pH i zwiększenie siły jonowej buforu lub przez dodanie EDTA lub imidazolu do buforu. Strukturę ligandu, kwasu iminodioctowego, przedstawiono na rysunku 48.

Wykres 48. Częściowa struktura Chelating Sepharose™ High Performance i Chelating Sepharose™ Fast Flow.

Metaloproteiny nie są zwykle odpowiednimi kandydatami do oczyszczania za pomocą chromatografii chelatowej, ponieważ mają tendencję do zmiatania jonów metali z kolumny.

.

Opcje oczyszczania

	Wiążąca pojemność	Maksymalny przepływ operacyjny	Komentarze
Moduł oczyszczania His MicroSpin	100 µg/kolumna	Nie dotyczy	Gotowe do użycia, wstępnie zapakowane kolumny, bufory i chemikalia do oczyszczania białek fuzyjnych (His)6 .
HiTrap® Chelating HP 1 mL	12 mg/kolumna	4 mL/min	Kolumna zapakowana, gotowa do użycia.
HiTrap® Chelating HP 5 mL	60 mg/kolumna	20 mL/min	Kolumna zapakowana, gotowa do użycia.
HisTrap™ Kit	12 mg/kolumna*	4 mL/min	Gotowe do użycia, wstępnie zapakowane kolumny, bufory i chemikalia do oczyszczania białek fuzyjnych (His)6 do 12 oczyszczeń przy użyciu strzykawki.
Chelating Sepharose™ Fast Flow	Podłoże 12 mg/ml	400 cm/h**	Dostarczana jako zawiesina do pakowania  kolumn i zwiększania skali.

* Oszacowanie dla (His)₆ białka fuzyjnego o M_r 27 600, zdolność wiązania różni się w zależności od konkretnego białka.
** Patrz  Załącznik 4 w celu przeliczenia przepływu liniowego (cm/h) na objętościowe natężenie przepływu. Maksymalny przepływ operacyjny jest obliczany na podstawie pomiaru w kolumnie z wypełnieniem o wysokości złoża 10 cm i średnicy wewnętrznej 5 cm.

Przykład oczyszczania

.

Wykres 49. Oczyszczanie białek jaja kurzego na HiTrap^® Chelating HP 1 ml, przy użyciu jonu metalu Cu^2+.

Próbka:	200 µL białka jaja kurzego (10% w buforze wiążącym przefiltrowane przez filtr szklany)
Kolumna:	HiTrap® Chelating HP, 1 mL, Cu2+-załadowany zgodnie z instrukcją
Bufor wiążący:	0.02 M fosforan sodu, 1 M NaCl, pH 7,2
Bufor elucyjny:	0.02 M fosforan sodu, 1 M NH4Cl, pH 7.2
Przepływ:	0.5 mL/min
Elucja:	8 mL liniowego gradientu 0-100% buforu elucyjnego

.

Development of a Separation Protocol

Szczegóły konkretnego protokołu oczyszczania znajdują się na stronie 50 (His MicroSpin Purifcation Module, HisTrap™ Kit, HiTrap^® Chelating HP, Chelating Sepharose™ Fast Flow - Performing a separation). Protokół ten może być wykorzystany jako podstawa do opracowania metod oczyszczania dla innych białek i peptydów z powinowactwem do jonów metali, jak pokazano na rysunku 49.

Ponowne użycie kolumn oczyszczających zależy od charakteru próbki i powinno być brane pod uwagę tylko podczas przetwarzania identycznych próbek w celu uniknięcia zanieczyszczenia krzyżowego.

Wybór jonu metalu

Następujące wytyczne mogą być wykorzystane do wstępnych eksperymentów w celu wyboru jonu metalu, który jest najbardziej przydatny dla danej separacji:

• Cu²⁺ daje silne wiązanie, a niektóre białka będą wiązać się tylko z Cu²⁺. Załaduj roztwór odpowiadający 60% objętości wypełnionej kolumny, aby uniknąć wycieku jonów metali podczas nakładania próbki. Alternatywnie, medium może być nasycone, a krótka wtórna nienaładowana kolumna HiTrap^® Chelating HP lub wypełniona Chelating Sepharose™ Fast Flow powinna być podłączona szeregowo za główną kolumną w celu zebrania nadmiaru jonów metali.
• Zn²⁺ daje słabsze wiązanie, co w wielu przypadkach można wykorzystać do osiągnięcia selektywnej elucji mieszaniny białek. Załaduj roztwór odpowiadający 85% objętości upakowanej kolumny, aby naładować kolumnę.
• Ni²⁺ jest powszechnie stosowany do białek fuzyjnych poli (His). Roztwór Ni²⁺ odpowiadający połowie objętości kolumny jest zwykle wystarczający do naładowania kolumny.
• Co²⁺ i Ca²⁺ są również alternatywami.

Naładuj kolumnę jonami metali, przepuszczając przez kolumnę roztwór odpowiedniej soli, np. 0,1 M ZnCl₂, NiSO₄ lub CuSO₄ w wodzie destylowanej. W przypadku innych metali można stosować sole chlorkowe.

W celu określenia, kiedy kolumna jest naładowana, można zastosować kilka metod. Jeśli podczas ładowania używany jest roztwór soli metalu w wodzie destylowanej, eluat początkowo ma niskie pH i powraca do neutralnego pH, gdy medium zostaje nasycone jonami metalu. Postęp ładowania jonami Cu²⁺ można łatwo śledzić wzrokowo (zawartość kolumny staje się niebieska). Podczas ładowania kolumny jonami cynku, węglan sodu może być użyty do wykrycia obecności cynku w eluacie.

Wybór buforu wiążącego

Outralne lub lekko zasadowe pH będzie sprzyjać wiązaniu. Odpowiednimi buforami są Tris-octan (0,05 M), fosforan sodu (0,02-0,05 M) i Tris-HCl (0,02-0,05 M). Tris-HCl ma tendencję do zmniejszania wiązania i powinien być stosowany tylko wtedy, gdy powinowactwo metal-białko jest dość wysokie.

Wysokie stężenia soli lub detergentów w buforze zwykle nie mają wpływu na adsorpcję białka i dobrą praktyką jest utrzymywanie wysokiej siły jonowej (np. 0,5-1 M NaCl), aby uniknąć niepożądanych efektów wymiany jonowej.

Środki chelatujące, takie jak EDTA lub cytrynian, nie powinny być dodawane, ponieważ usuwają jony metali z pożywki.

Choice of Elution Buffers

Różnicową elucję związanych substancji można uzyskać stosując gradient środka, który konkuruje o ligand lub cząsteczki docelowe. Można użyć zwiększonego stężenia imidazolu (0-0,5 M), chlorku amonu (0-0,15 M) lub substancji takich jak histamina lub glicyna o powinowactwie do chelatowanego metalu. Ponieważ pH reguluje stopień jonizacji naładowanych grup w miejscach wiązania, gradient lub stopniowe obniżanie pH może być stosowane do niespecyficznej elucji związanego materiału. Zakres pH 7,0-4,0 jest normalny, większość białek eluuje między pH 6,0 a 4,2. Można stosować eluenty deformujące, takie jak 8 M mocznik lub 6 M chlorowodorek guanidyny.

Elucja z EDTA (0,05 M) lub innymi silnymi środkami chelatującymi usunie jony metali i inne związane materiały. Metoda ta zazwyczaj nie rozdziela różnych białek.

Jeśli stosowane są ostre warunki elucji, zaleca się natychmiastowe przeniesienie eluowanych frakcji do łagodniejszych warunków (albo poprzez zebranie ich w buforze neutralizującym, albo poprzez przejście bezpośrednio na kolumnę odsalającą w celu wymiany buforu (strona 133, & nbsp;).nbsp;Buffer exchange and desalting).

Utrata jonów metali jest bardziej wyraźna przy niższym pH. Kolumna nie musi być usuwana między kolejnymi oczyszczaniami, jeśli oczyszczane jest to samo białko, jak pokazano na rysunku 50.

Próbki:	2.5 ml ekstraktu komórkowego zawierającego wyrażony GST-(His)6
Bufor wiążący:	20 mM fosforan sodu, 0.5 M NaCl, 20 mM imidazol, pH 7.4
Elucja bufor:	20 mM fosforan sodu, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazol, pH 7.4
Przepływ:	2 ml/min, 312 cm/h
Uwaga:	Brak przeładowania kolumny Ni2+ pomiędzy przebiegami

.

Rysunek. 50 10 powtarzalnych oczyszczeń GST-(His)₆ bez przeładowywania kolumny Ni²⁺ pomiędzy seriami.

Wynik: Nr serii.	Eluted GST-(His)6, total mg
1	2.76
2	2.82
3	2.83
4	2.72
5	2.71
6	2.65
7	2.64
8	2.63
9	2.54
10	2.59

.

Chociaż wyciek metalu jest bardzo niski, obecności jakiegokolwiek wolnego metalu w oczyszczonym produkcie można uniknąć, podłączając nienaładowaną kolumnę HiTrap^® Chelating HP szeregowo za pierwszą kolumną i przed eluowaniem białka. Kolumna ta wiąże wszelkie jony metali, usuwając je z białka, gdy przechodzi ono przez drugą kolumnę.

Skala działania

Aby zwiększyć wydajność należy użyć kilku kolumn HiTrap^® Chelating HP (1 mL lub 5 mL) w szeregu (należy pamiętać, że ciśnienie wsteczne wzrośnie) lub, w celu uzyskania jeszcze większej pojemności, zapakować Chelating Sepharose™ Fast Flow do odpowiedniej kolumny (Załącznik 3, Pakowanie i przygotowanie kolumny).

Czyszczenie

Usuń jony metali przez przemycie 5 objętościami kolumny 20 mM fosforanem sodu, 0.5 M NaCl, 0,05 M EDTA, pH 7,4.

Usuń wytrącone białka przez wypełnienie kolumny 1 M NaOH i inkubuj przez 2 godziny. Wypłukać rozpuszczone białka za pomocą 5 objętości wody i buforu o pH 7,0, aż pH przepływu osiągnie pH 7,0.

Alternatywnie przemywać niejonowym detergentem, takim jak 0,1% Triton X-100 w temperaturze +37 °C przez 1 min. Usunąć lipidy i bardzo hydrofobowe białka przez przemywanie 70% etanolem lub gradientem piłokształtnym 0%-30%-0% izopropanol/woda.

.

Charakterystyka mediów

	Skład	Pojemność jonów metali	Stabilność pH*	Średnia wielkość cząstek
Chelating Sepharose™ High Performance	Kwas aminodioctowy sprzężony z Sepharose™ High Performance poprzez wiązanie eterowe.	23 µmoli Cu2+/mL	Krótkoterminowe 2-14 Długoterminowe 3-13	34 µM
Chelating Sepharose™ Fast Flow	Sepharose™ Fast Flow sprzężona z kwasem aminodioctowym poprzez ramię dystansowe przy użyciu sprzęgacza epoksydowego.	22-30 µmoli Zn2+/mL	Krótkoterminowe 2-14 Długoterminowe 3-13	90 µM

Stabilność chemiczna

Stabilny we wszystkich powszechnie stosowanych buforach wodnych i denaturantach, takich jak 6 M chlorowodorek guanidyny, 8 M mocznik i inne środki chaotropowe.

Przechowywanie

Przepłukać nośniki i kolumny 20% etanolem o neutralnym pH (użyć około 5 objętości kolumn dla zapakowanych nośników) i przechowywać w temperaturze od +4 do +8 °C.

Przed długotrwałym przechowywaniem należy usunąć jony metali, przemywając kolumnę pięcioma objętościami 20 mM fosforanu sodu, 0,5 M NaCl, 0,05 M EDTA, pH 7,4.

Po długotrwałym przechowywaniu kolumnę należy ponownie naładować jonami metali.