Oczyszczanie plazmidów za pomocą chromatografii jonowymiennej z użyciem zestawów Genopure

Rysunek 1. Procedura oczyszczania plazmidów Genopure. Schematyczne przedstawienie oczyszczania lizatów przez filtrację

Chromatografia jonowymienna jest stosowana w zestawach Genopure Plasmid Midi Kit i Genopure Plasmid Maxi Kit. Metoda izolacji opiera się na zmodyfikowanym protokole lizy alkalicznej i może być podzielona na następujące etapy przedstawione również na Rysunku 1:

• Zbiór i rozerwanie komórek bakteryjnych
• Precypitacja bakteryjnego "chromosomalnego&DNA
• Klarowanie lizatu bakteryjnego
• Usuwanie pozostałości zanieczyszczeń poprzez etapy przemywania
• Elucja plazmidowego DNA w warunkach wysokiej zawartości soli
• Koncentracja i usuwanie soli poprzez wytrącanie alkoholu

Metoda izolacji jest zoptymalizowana dla kultur hodowanych w podłożu LB; inne bogate podłoża mogą wymagać zwiększonych objętości buforu do zawieszania, lizy i neutralizacji oraz dodatkowego etapu płukania. Procedura izolacji jest odpowiednia dla wszystkich rozmiarów plazmidów; lizaty większych konstruktów (do 100 kb) należy oczyścić przez filtrację, aby uniknąć ścinania.

Wydajność preparatów plazmidowego DNA zależy od kilku parametrów, takich jak jakość wzrostu kultury bakteryjnej, ilość użytej zawiesiny kultury do przygotowania, rodzaj użytego plazmidu itp. Z reguły typowa wydajność plazmidu o wysokiej liczbie kopii wynosi około 3 - 5 µg DNA na ml oryginalnej kultury bakteryjnej (pUC, pTZ, pGEM w popularnych szczepach gospodarza, takich jak XL-1 blue, HB101, JM 109). Typowa wydajność plazmidów o niskiej liczbie kopii wynosi około 0,2 - 1 µg DNA na ml oryginalnej hodowli bakteryjnej.

Zestawy Genopure są dostarczane ze złożonymi filtrami, aby wyeliminować czasochłonny etap wirowania po lizie alkalicznej. W ciągu około 2 minut (midi) lub 10 minut (maxi), odpowiednio, bez nadzoru, szczątki komórkowe i osady dodecylosiarczanu potasu są zatrzymywane przez filtr, unikając w ten sposób ścinania dużych konstruktów DNA. Oprócz znacznego skrócenia czasu przygotowania, kolejną zaletą filtracji jest to, że nawet małe osady SDS, których nie można oddzielić za pomocą konwencjonalnego wirowania, są całkowicie usuwane.