Rozwiązywanie problemów z chromatografią jonowymienną
Rysunek 1.Idealna separacja IEX: białka docelowe dobrze rozdzielone przez elucję gradientową
Jeśli tylko niektóre piki są interesujące w tym dobrze rozdzielonym rozdziale, korzystne może być przejście do elucji etapowej w celu zaoszczędzenia czasu i buforu. Pozostała część tej sekcji koncentruje się na praktycznych problemach, które mogą prowadzić do nieidealnej separacji IEX.
Rysunek 2.Próbka eluuje przed rozpoczęciem gradientu soli
Należy upewnić się, że bufory znajdują się w odpowiednich pojemnikach. Zmniejsz siłę jonową próbki przez odsolenie, strona 156 lub rozcieńczenie buforem startowym. W przypadku wymieniacza anionowego zwiększyć pH buforu, w przypadku wymieniacza kationowego zmniejszyć pH buforu. Jeśli białka nadal nie wiążą się przy żadnym pH, możliwe jest, że kolumna została zanieczyszczona detergentem.
Rysunek 3.Próbka nadal eluuje po rozpoczęciu gradientu
Po nałożeniu próbki ślad UV musi powrócić do linii bazowej przed rozpoczęciem elucji, w przeciwnym razie białka, które nie wiążą się z kolumną, zakłócają separację. Zwiększ objętość buforu startowego (etap wyrównania) przed rozpoczęciem elucji gradientowej.
Rysunek 4.Próbka eluuje się podczas płukania wysoką solą
Białka wiążą się zbyt silnie. Upewnij się, że bufory znajdują się w odpowiednich pojemnikach. Jeśli używasz wymieniacza anionowego, zmniejsz pH buforu, jeśli używasz wymieniacza kationowego, zwiększ pH buforu.
Białko(a) będące przedmiotem zainteresowania eluujące późno w gradiencie
Białka wiążą się zbyt silnie. Zwiększ siłę jonową gradientu. Zaleca się zmianę pH, jeśli do elucji wymagane jest bardzo wysokie stężenie soli. W przypadku wymieniacza anionowego należy zmniejszyć pH buforu, a w przypadku wymieniacza kationowego zwiększyć pH buforu. Patrz także Tabela 6.
Białka będące przedmiotem zainteresowania eluują zbyt wcześnie w gradiencie:
Białka nie wiążą się silnie. Sprawdź siłę jonową gradientu. Zmień pH, w przypadku wymieniacza anionowego zwiększ pH buforu, a w przypadku wymieniacza kationowego zmniejsz pH buforu. Patrz także Tabela 6.
Białka będące przedmiotem zainteresowania nie są wystarczająco rozdzielone
Odnieś się do treści tego rozdziału, aby przejrzeć kluczowe parametry w celu poprawy rozdzielczości. Patrz także Tabela 6.
*Polarne rozpuszczalniki organiczne, takie jak metanol, etanol, izopropanol i acetonitryl mogą być stosowane w stężeniach od 0-20%, ale należy pamiętać, że niektóre białka mogą nieodwracalnie utracić swoją aktywność biologiczną w obecności rozpuszczalników organicznych. Przed uruchomieniem kolumny należy sprawdzić rozpuszczalność próbki i buforu, pH buforu i stabilność chemiczną medium.
Należy pamiętać, że ciśnienie wsteczne może wzrosnąć podczas pracy z roztworami organicznymi.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?