Narzędzia i techniki hodowli komórek 3D

• Kultura komórkowa 2D vs 3D
  
• Advantages of 3D Cell Culture
• .Przegląd technik hodowli komórek 3D
• Techniki oparte na rusztowaniach
• Techniki bez rusztowań

2D vs 3D techniki hodowli komórkowych

Hodowla komórkowa techniki są wszechobecne w obszarach biologii rozwojowej, odkrywania leków, medycyny regeneracyjnej i produkcji białek. Od czasu wprowadzenia technik hodowli komórkowych, komórki były hodowane w dwóch wymiarach, przymocowane do plastikowych naczyń do hodowli tkanek lub białek mocujących ECM. Komórki w środowisku fizjologicznym stale oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową, regulując złożone funkcje biologiczne, takie jak migracja komórkowa, apoptoza, regulacja transkrypcji i ekspresja receptorów¹. Dane eksperymentalne in vitro nie mogą być w pełni przełożone na badania kliniczne² gdy komórki są hodowane w warunkach 2D, ponieważ nie można odtworzyć skomplikowanych sygnałów komórkowych między komórkami a ich macierzą³.Trójwymiarowe hodowle komórkowe odnoszą się do tego wyzwania i służą jako lepszy model reprezentujący ściśle warunki fizjologiczne in vivo. Tabela 1 wskazuje różnicę między systemami hodowli komórek 2D i 3D.

Tabela 1. Zachowanie komórek: warunki hodowli komórkowej 2D vs 3D.

Kluczowe cechy	Kultura komórkowa 2D	Kultura komórkowa 3D	Referencje
Kształt komórki	Płaski i rozciągnięty	Naturalny kształt (elipsoida/polaryzacja) jest zachowany	10.3390/ijms160355173
Połączenie komórek z pożywką	Wszystkie komórki są jednakowo narażone na działanie składników pożywki	Podobnie jak w warunkach fizjologicznych, istnieje gradient dostępności składników pożywki. Górna warstwa komórek jest bardziej narażona niż dolna (ekspozycja niejednorodna)	10.1016/j.semcancer.2005.05.0024, 10.1016/j.bbrc.2013.03.0085
Połączenia komórkowe	Połączenia komórkowe są mniej rozpowszechnione i nie przypominają warunków fizjologicznych	Połączenia komórkowe są rozpowszechnione i umożliwiają komunikację między komórkami.	10.1371/journal.pone.00381476
Różnicowanie komórek	Umiarkowanie i słabo zróżnicowane	Dobrze zróżnicowane	10.1016/j.yexcr.2012.09.0127
Metabolizm leków	Metabolizm leków nie został dobrze zaobserwowany	Zwiększony metabolizm leków ze zwiększoną ekspresją enzymów CYP	10.1007/s00204-013-1080-y8, 10.1089/ten.2006.12.13579
Wrażliwość na leki	Komórki są wrażliwe, a leki wykazują wysoką skuteczność	Komórki często wykazują oporność, a leki wykazują niską skuteczność	10.1111/j.1469-7580.2007.00778.x10
Proliferacja komórek	Wyższy wskaźnik proliferacji niż w środowisku naturalnym	Stopień proliferacji może być wysoki lub niski, zależy to od typu komórek i techniki hodowli komórek 3D.	10.1007/s11626-997-0061-y11, 10.1016/j.biomaterials.2004.05.02812
Response to Stimuli	Słaba odpowiedź na bodźce mechaniczne komórek	dobrze ugruntowane odpowiedzi na bodźce mechaniczne komórek	10.1038/srep1955013
Zywotność	Wrażliwy na cytotoksynę	Większa żywotność i mniejsza podatność na czynniki zewnętrzne	10.1111/j.1469-7580.2007.00778.x10
Apoptoza	Wysoka podatność na apoptozę indukowaną lekami	Zwiększona odporność na bodźce apoptotyczne indukowane lekami	10.3892/or_0000016714

Co więcej, kilka badań wykazało różnicę w profilach ekspresji genów i białek komórek hodowanych w środowisku 3D w porównaniu do ich odpowiedników 2D. Ponadto, profile ekspresji w warunkach hodowli 3D są uważane za bardziej istotne fizjologicznie niż warunki hodowli komórek 2D.

Zalety hodowli komórkowej 3D

Zdarzenia komórkowe w hodowli 3D ściśle przypominają warunki fizjologiczne i mają następujące wyraźne zalety w porównaniu do warunków hodowli 2D

• Komórki macierzyste hodowane w 3D wykazują znacznie wyższy potencjał różnicowania¹⁵.
• Badania bezpieczeństwa i skuteczności leków są wydajne i stosunkowo łatwiejsze do przeprowadzenia w kulturach 3D, co skraca czas poświęcany na odkrywanie leków przez firmy farmaceutyczne¹⁶. Hepatotoksyczność wywołana lekami może być skutecznie badana w modelach komórkowych 3D¹⁶.
• Kultury 3D dostarczają lepszych danych w przewidywaniu oporności na leki. Środki alkilujące wykazały oporność w hodowli 3D, która była porównywalna z guzami in vivo¹⁷.
• Patogeneza wirusowa, w tym wzrost wirusa, infekcja i interakcje patogen-gospodarz, może być badana przy zmniejszonym poziomie zagrożenia przy użyciu modeli 3D¹⁸.

Przegląd technik hodowli komórkowych 3D

Wybór techniki hodowli komórkowej 3D powinien zależeć od kilku parametrów, w tym charakteru samych komórek (linia komórkowa, komórka pierwotna, pochodzenie tkankowe) lub ostatecznego celu badania. Kluczowe znaczenie ma ocena tych parametrów przed wyborem najbardziej odpowiedniej techniki hodowli komórek 3D.

Ogólnie rzecz biorąc, techniki hodowli komórek 3D są klasyfikowane jako techniki oparte na rusztowaniach lub techniki nieoparte na rusztowaniach.

Techniki oparte na rusztowaniach

W technikach opartych na rusztowaniach komórki są hodowane w obecności podłoża. Można zastosować 2 główne rodzaje wsparcia:

1. Wsparcie oparte na hydrożelu: hydrożele są z definicji sieciami polimerowymi intensywnie spęcznionymi wodą. Komórki mogą być osadzone w tych hydrożelach lub po prostu pokryte na powierzchni. W zależności od rodzaju polimeru, hydrożele można podzielić na różne kategorie (hydrożele oparte na białkach ECM, hydrożele naturalne i hydrożele syntetyczne) o różnych właściwościach.
2. Podłoże na bazie twardego materiału polimerowego: komórki są hodowane w obecności włókien lub struktur gąbczastych: komórki odzyskują bardziej fizjologiczny kształt, ponieważ nie są ułożone na płaskiej powierzchni. Materiałami stosowanymi do tych podłoży mogą być polistyren (przystosowany do badań obrazowych ze względu na swoją przezroczystość), ale także biodegradowalne narzędzia, takie jak polikaprolakton.
   
   Atrybuty związane z tymi rusztowaniami podsumowano w poniższej tabeli:

Tabela 2. Przegląd technik 3D opartych na rusztowaniach wraz z atrybutami.

Przydatność: +++ = Wysoka; ++ = Średnia; + = Niska; - = Nieodpowiednia; +/- = różni się w zależności od komponentów rusztowania

Techniki Atrybuty	Skafoldy na bazie ECM	Naturalne hydrożele	Syntetyczne hydrożele&	Polimerowe Twarde rusztowania
Opis produktu	Laminina, Kolagen, ŻelECM	Hystem®	TrueGel3D™, Hydromatrix™	3D Biotek Inserts, Cellusponge, Gelatin Scaffolds
Znaczenie biologiczne	+++	+++	+/-	+/-
Zgodność/Powtarzalność	-	++	+++	+++
Ryzyko zanieczyszczenia	-	++	+++	+++
Modularność/Dostosowanie	-	+	++	-
Cell Retrieval	+/-	+	++	+++
Analiza dalszych etapów (obrazowanie, analiza molekularna)	+	++	++	++
Analiza HTS/HCS	+/-	+/-	+	-

Techniki bezrusztowe

Techniki bezrusztowe pozwalają komórkom na samoorganizację w celu utworzenia nieprzylegających agregatów komórkowych zwanych sferoidami. Sferoidy naśladują tkanki stałe, wydzielając własną macierz zewnątrzkomórkową i wykazując zróżnicowaną dostępność składników odżywczych. Sferoidy wyhodowane za pomocą technik nieopartych na rusztowaniach mają spójny rozmiar i kształt i są lepszymi modelami komórkowymi in vitro do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Do generowania sferoidów można wykorzystać różne platformy, od wyspecjalizowanych płytek do bardziej zintegrowanych systemów: atrybuty tych technik opisano w poniższej tabeli.

Nota aplikacyjna: Proliferacja nowotworowych komórek macierzystych w ludzkich liniach komórkowych raka prostaty i raka piersi przy użyciu nowego, zdefiniowanego, pozbawionego surowicy podłoża sferoidalnego 3D

Przewodnik po protokole: Protokół tworzenia nowotworowych komórek macierzystych

Tabela 3. Przegląd techniki 3D bez rusztowań z atrybutami.

Przydatność: +++ = Wysoka; ++ = Średnia; + = Niska; - = Nieodpowiednia

Atrybuty technologii	Mikropłytki o niskim poziomie mocowania	Systemy mikroprzepływowe	Bioreaktory
Opis produktu	Płytki sferoidalne Corning®	Płytki gradientowe CellASIC ONIX	Corning® Spinner Flask lub Roller Bottles
Long Term Culture	++	+++	+++
Pobieranie komórek	+++	-	+++
Analiza obrazu	+++	+++	-
Efektywność kosztowa	++	-	-
Analiza HCS/HTS	+++	-	+

Ewolucja Hodowla komórek 3D ma potencjał, aby wypełnić lukę między in vitro i in vivo eksperymentami. Wygoda obchodzenia się z komórkami in vitro przy jednoczesnym uzyskiwaniu wyników odzwierciedlających in vivo stan i unikaniu obaw etycznych związanych z wykorzystywaniem zwierząt sprawia, że techniki hodowli komórek 3D stają się coraz bardziej popularne wśród badaczy, ale wybór odpowiedniego systemu do opracowania modelu hodowli komórek 3D nie jest trywialnym pytaniem.

W przyszłości pojawią się bardziej złożone i zaawansowane technologie, takie jak Biodruk 3D, pochodna druku 3D, pomocna w drukowaniu zarówno biomateriałów, jak i żywych komórek. Biodruk 3D ma szerokie zastosowanie medyczne, takie jak przeszczep skóry, który pozwala uniknąć drugiego miejsca rany, charakterystycznego dla tradycyjnych metod przeszczepu. Główne komponenty do biodruku 3D, takie jak bio-tusze, materiał rusztowania i biomateriały, są stosunkowo dobrze znane światu naukowemu. Konfigurując kolejność i położenie tych komponentów, można opracować różne produkty tkankowe, symulując środowisko fizjologiczne¹⁹. W chwili obecnej technika ta znajduje się na wczesnym etapie, ale ma potencjał, aby ewoluować jako niezbędne narzędzie do odkrywania leków i badań toksyczności.

Referencje

1. Kleinman HK, Philp D, Hoffman MP. 2003. Role of the extracellular matrix in morphogenesis. Current Opinion in Biotechnology. 14(5):526-532. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2003.08.002

2. Hutchinson L, Kirk R. 2011. High drug attrition rates?where are we going wrong?. Nat Rev Clin Oncol. 8(4):189-190. https://doi.org/10.1038/nrclinonc.2011.34

3. Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Three-Dimensional Cell Culture: A Breakthrough in Vivo. IJMS. 16(12):5517-5527. https://doi.org/10.3390/ijms16035517

4. Kim JB. 2005. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15(5):365-377. https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2005.05.002

5. Yip D, Cho CH. 2013. A multicellular 3D heterospheroid model of liver tumor and stromal cells in collagen gel for anti-cancer drug testing. Biochemical and Biophysical Research Communications. 433(3):327-332. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2013.03.008

6. Soares CP, Midlej V, Oliveira MEWd, Benchimol M, Costa ML, Mermelstein C. 2D and 3D-Organized Cardiac Cells Shows Differences in Cellular Morphology, Adhesion Junctions, Presence of Myofibrils and Protein Expression. PLoS ONE. 7(5):e38147. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0038147

7. Chitcholtan K, Asselin E, Parent S, Sykes PH, Evans JJ. 2013. Differences in growth properties of endometrial cancer in three dimensional (3D) culture and 2D cell monolayer. Experimental Cell Research. 319(1):75-87. https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2012.09.012

8. Schyschka L, Sánchez JJM, Wang Z, Burkhardt B, Müller-Vieira U, Zeilinger K, Bachmann A, Nadalin S, Damm G, Nussler AK. 2013. Hepatic 3D cultures but not 2D cultures preserve specific transporter activity for acetaminophen-induced hepatotoxicity. Arch Toxicol. 87(8):1581-1593. https://doi.org/10.1007/s00204-013-1080-y

9. Elkayam T, Amitay-Shaprut S, Dvir-Ginzberg M, Harel T, Cohen S. 2006. Enhancing the Drug Metabolism Activities of C3A? A Human Hepatocyte Cell Line?By Tissue Engineering Within Alginate Scaffolds. Tissue Engineering. 12(5):1357-1368. https://doi.org/10.1089/ten.2006.12.1357

10. Bokhari M, Carnachan RJ, Cameron NR, Przyborski SA. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anatomy. 0(0):070816212604002-???. https://doi.org/10.1111/j.1469-7580.2007.00778.x

11. Chopra V, Dinh TV, Hannigan EV. 1997. Three-dimensional endothelial-tumor epithelial cell interactions in human cervical cancers. In Vitro Cell.Dev.Biol.-Animal. 33(6):432-442. https://doi.org/10.1007/s11626-997-0061-y

12. Torisawa Y, Shiku H, Yasukawa T, Nishizawa M, Matsue T. 2005. Multi-channel 3-D cell culture device integrated on a silicon chip for anticancer drug sensitivity test. Biomaterials. 26(14):2165-2172. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2004.05.028

13. Li Y, Huang G, Li M, Wang L, Elson EL, Jian Lu T, Genin GM, Xu F. 2016. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Sci Rep. 6(1): https://doi.org/10.1038/srep19550

14. Li. 1994. Survival advantages of multicellular spheroids vs. monolayers of HepG2 cells in vitro. Oncol Rep. https://doi.org/10.3892/or_00000167

15. Liu H, Roy K. 2005. Biomimetic Three-Dimensional Cultures Significantly Increase Hematopoietic Differentiation Efficacy of Embryonic Stem Cells. Tissue Engineering. 11(1-2):319-330. https://doi.org/10.1089/ten.2005.11.319

16. Meng Q. 2010. Three-dimensional culture of hepatocytes for prediction of drug-induced hepatotoxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 6(6):733-746. https://doi.org/10.1517/17425251003674356

17. Kobayashi H, Man S, Graham CH, Kapitain SJ, Teicher BA, Kerbel RS. 1993. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90(8):3294-3298. https://doi.org/10.1073/pnas.90.8.3294

18. Barrila J, Radtke AL, Crabbé A, Sarker SF, Herbst-Kralovetz MM, Ott CM, Nickerson CA. 2010. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host?pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8(11):791-801. https://doi.org/10.1038/nrmicro2423

19. Zhu W, Ma X, Gou M, Mei D, Zhang K, Chen S. 2016. 3D printing of functional biomaterials for tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 40103-112. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2016.03.014