Hydrożel TrueGel3D™ do hodowli komórek 3D

Wprowadzenie

Funkcje i zalety TrueGel3D™.

Protokoły i wsparcie

Jak działa TrueGel3D™?

Jak korzystać z systemu TrueGel3D™

Wybór odpowiedniego zestawu TrueGel3D™ do danego zastosowania

Przegląd chemii

Poproś o informacje

Wprowadzenie

TrueGel3D™ to biochemicznie zdefiniowany hydrożel utworzony przez zmieszanie polimerów z substancjami sieciującymi. W porównaniu do innych hydrożeli opartych na biologicznym ekstrakcie z komórek zwierzęcych (np. mysich komórek nowotworowych EHS), TrueGel3D™ nie zawiera żadnych produktów pochodzenia zwierzęcego, które mogłyby zakłócać lub zanieczyszczać eksperymenty. Co więcej, składniki zawarte w TrueGel3D™ zachowują żywotność i pozwalają naśladować krytyczne cechy naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Replikują one natywne środowiska komórkowe podobne do tych w tkankach, wspierając adhezję i migrację komórek. Technologia TrueGel3D™ zapewnia mechaniczne i biochemiczne wskazówki do badania zarówno morfologicznych, jak i fizjologicznych właściwości komórek w środowisku 3D. Wreszcie, hydrożele te umożliwiają hermetyzację komórek w celu wzrostu w środowisku 3D, które dokładniej naśladuje natywne środowisko tkankowe w porównaniu z tradycyjnymi warunki kultury komórkowej.

Funkcje i zalety TrueGel3D™

• TrueGel3D™ działa z wieloma komórkami (MDCK, nabłonkowymi, fibroblastami, nowotworowymi, pierwotnymi, w tym limfocytami, zrębowymi i embrionalnymi komórkami mięśnia sercowego).
• Podstawowe składniki TrueGel3D™ (dekstran, PVA, PEG) tworzą podstawowe rusztowanie hydrożelowe, które nie koliduje z komórkami
• Żele są przezroczyste, umożliwiając obrazowanie komórek
• Dostępnych jest wiele zestawów TrueGel3D™ o różnych prędkościach żelowania, wspierających różnorodne zastosowania (podsumowane w tabeli 2)
• Zestawy TrueGel3D™ są przezroczyste./li>
• Nietoksyczna opcja odzyskiwania komórek

Co najważniejsze, TrueGel3D™ ma zdefiniowany skład, w przeciwieństwie do ekstraktów błon podstawnych pochodzących z komórek zwierzęcych, w których mieszanka składników ECM i czynników wzrostu może zakłócać działanie komórek, ponieważ tworzy nienatywne środowisko.

Protokoły i wsparcie

• Protokół 1: Przygotowanie hydrożelu TrueGel3D™, CD sieciującego komórki i peptydu RGD (TRUE1)
• Protokół 2: Przygotowanie szybkich hydrożeli (True2-5)
• Protokół 3: Preparation of Slow hydrogels (True6-9)
• Zaawansowany protokół optymalizacji hydrożelu
• Uwagi dotyczące aplikacji
• High-Throughput 3D Cell Culture Using TrueGel3D^®
• Nota aplikacyjna dotycząca tworzenia torbieli w komórkach MDCK
• Rozprzestrzenianie się fibroblastów
• Co-culture of tumor and stromal cells

Jak działa TrueGel3D™?

Technologia TrueGel3D™ to czteroskładnikowy system składający się z:

• Polimer TrueGel3D™: alkohol poliwinylowy (PVA) lub dekstran
• Sieciowniki: dwa różne funkcjonalizowane tiolowo czynniki sieciujące (glikol polietylenowy (PEG) lub cyklodekstryna (CD)), które zapewniają wiązanie chemiczne łączące łańcuchy polimerowe i tworzące hydrożel
• Składniki interaktywne komórek: gdy wymagana jest adhezja komórek do macierzy, do mieszaniny można dodać peptydy zawierające sekwencje adhezyjne, takie jak TrueGel3D™ Arg-Gly-Asp (RGD) integrynowy peptyd adhezyjny. Można również dodać inne bioaktywne składniki, takie jak białka macierzy zewnątrzkomórkowej (np. fibronektyna, laminina), peptydy, siarczan heparanu lub czynniki wzrostu (nie zawarte w zestawach).
• Komórki zdefiniowane przez użytkownika (nie zawarte w zestawach)

Rysunek 1. Technologia TrueGel3D

Jak korzystać z systemu TrueGel3D™

Rysunek 2. Schemat blokowy protokołu TrueGel3D™

Wybór odpowiedniego zestawu TrueGel3D™ do danego zastosowania

Tabela 1 Przewodnik wyboru TrueGel3D™

Produkt	TRUE1	TRUE2	TRUE2	TRUE3	TRUE4	TRUE5	TRUE6	TRUE7	TRUE8	TRUE9
Polimer szkieletowy TrueGel3D™	Dekstran	Dekstran	Dekstran	PVA	PVA	Dekstran	Dekstran	Dekstran	PVA	PVA
Umożliwia regenerację komórek	✔	✔	✔			✔	✔
Pozwala na migrację komórek	✔		✔	✔			✔	✔
Zawiera peptyd RGD	✔
Tuneble Gel Stiffness						✔	✔	✔	✔
Szybkość żelowania	Umiarkowana	Szybka	Szybka	Szybki	Szybki	Wolny	Wolny	Wolny

• Czy predefiniowany system będzie dla mnie odpowiedni, czy też będę musiał dostosować swoje środowisko?
  
  W przypadku wielu zastosowań, takich jak tworzenie sferoidów lub modeli współhodowli, można użyć wstępnie skonfigurowanego hydrożelu TrueGel3D™, sieciującego komórki CD.TrueGel3D™ hydrożel, CD sieciujący komórki i peptyd RGD  (TRUE1-1KT). Ten hydrożel zawiera określone stężenie miejsc adhezji komórek, umożliwia rozprzestrzenianie się i migrację komórek oraz może być degradowany w celu odzyskania komórek za pomocą enzymatycznego roztworu do odzyskiwania komórek TrueGel3D™ (TRUEENZ-500UL). Żel ten oferuje umiarkowaną sztywność i całkowite utworzenie żelu w ciągu około 20 minut.

Jeśli potrzebujesz zoptymalizować środowisko żelu (np. zmiana sztywności, cząsteczki adhezyjne, białka ECM itp.), dostępne są inne zestawy TrueGel3D™ wymienione w Tabeli 1.

• Jaka szybkość żelowania jest optymalna dla mojego zastosowania?

Płyn mieszany do*	Przykłady zastosowań**
Slow (do 10 min)	Użycie w mikrokanałach, strzykawkach do wstrzykiwań, testowanie sztywności żelu, sztywne hydrożele
Modele guzów i zrazików, tworzenie sferoidów, tworzenie torbieli i acini
Szybkie (do 1 min)	Szybkie konfiguracje kultur, osadzanie dużych próbek tkanek

*W tym czasie mieszanina ze wszystkimi składnikami pozostaje płynna; po tym czasie zaczyna tworzyć żel i nie może być już pipetowana.

**W celu uzyskania bardziej szczegółowego widoku zalecanych żeli według aplikacji, należy zapoznać się z Tabelą 2.

Umiarkowany czas żelowania jest dostępny tylko dla wstępnie skonfigurowanego hydrożelu TrueGel3D™, CD-degradowalnego środka sieciującego i peptydu RGD (nr kat. TRUE1-1KT). Zestawy do szybkiej i powolnej żelacji są wymienione w tabeli 1.

• Czy muszę dodawać składniki interaktywne dla komórek?
  
  Do niektórych zastosowań, takich jak unieruchamianie komórek lub tkanek w mikroskopii, można używać zestawów TruGel3D™ bez żadnych dodatkowych składników aktywnych. Peptyd TrueGel3D™ RDG jest wymagany do adhezji i rozprzestrzeniania się komórek (obecność degradowalnego sieciującego CD jest również niezbędna do rozprzestrzeniania się komórek).  Do hydrożelu można również dodać inne składniki komórkowe, takie jak czynniki wzrostu*, heparyna lub białka ECM (np. fibronektyna lub kolagen).
  * Należy pamiętać, że niektóre składniki mogą dyfundować poza żel, dlatego należy je dodać do pożywki do hodowli komórkowej.
  
  
• Czy odzyskiwanie komórek jest potrzebne do dalszej analizy lub hodowli?
  
  Komórki można odzyskać ze szkieletów TrueGel3D™ opartych na dekstranie przy użyciu enzymatycznego roztworu do odzyskiwania komórek TrueGel3D™ (więcej szczegółów w protokołach zaawansowanych). Komórek nie można odzyskać ze szkieletu TrueGel3D™ na bazie PVA.
  
  
• Czy moje zastosowanie wymaga hydrożelu ulegającego degradacji komórkowej?
  
  Jeśli chcesz badać rozprzestrzenianie się lub ruchliwość komórek, wymagane jest środowisko ulegające degradacji komórkowej. Oferujemy szeroki wybór zestawów TrueGel3D™ zawierających sieciujący, degradowalny przez komórki CD, który zawiera sekwencje peptydowe miejsca rozszczepienia metaloproteazy macierzy (MMP)*. Degradując środek sieciujący, komórki mogą rozprzestrzeniać się wewnątrz hydrożelu (w obecności ligandu przylegającego do komórek, takiego jak peptyd adhezyjny integryny RGD).
  
  *Wykazano, że nie wszystkie MMP rozszczepiają łącznik CD. CD-Link zawiera sekwencję Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala, o której wiadomo, że jest rozszczepiana przynajmniej przez MMP1, MMP3, MMP7 i MMP9.

Tabela 2 Wybór TrueGel3D™ według zastosowania

Product	TRUE1	TRUE2	TRUE3	TRUE4	TRUE5	TRUE6	TRUE7	TRUE8
Sferoidy: wzrost niezależny od otaczającej macierzy_ brak wzrostu/inwazji		✔			✔	✔			✔
Sferoidy: wzrost zależny od adhezyjnej macierzy otaczającej komórki_ brak wzrostu/inwazji*		✔*			✔*	✔*			✔*
Test migracji komórek/inwazji*	✔		✔*	✔*			✔*	✔*
Acini i tworzenie torbieli nabłonkowych*	✔	✔*		.	✔*	✔*			✔*
Tumor-stroma co-culture	✔		✔*	✔*			✔*	✔*
Wpływ sztywności podłoża na fizjologię/zachowanie komórek						✔	✔	✔	✔
Immobilizacja komórek i tkanek z odzyskiem		✔				✔
Immobilizacja komórek i tkanek bez odzysku					✔				✔
Bariera fizyczna bez interakcji komórkowych		✔			✔	✔			✔
Użycie mikrokanałów	✔					✔	✔	✔	✔
Napełnianie strzykawek	✔					✔	✔	✔	✔
Stabilna hodowla długoterminowa >2 tygodnie; nie wymaga odzyskiwania komórek				✔	✔			✔	✔
Odzyskiwanie komórek do dalszych zastosowań, takich jak strona SDS, barwienie immunologiczne, pasażowanie itp.	✔	✔	✔			✔	✔

*Peptyd adhezyjny TrueGel3D™ RGD (dostarczany jako oddzielny składnik) wymaga dodania

Chemistry Overview

.

Polimery i środki sieciujące o różnych właściwościach zapewniają opcje spełniające wymagania dotyczące żelu

Systemy hydrożelowe TrueGel3D™ wykorzystują jeden z dwóch rodzajów polimerów: syntetyczny, nierozkładalny alkohol poliwinylowy (PVA) lub enzymatycznie rozkładalny dekstran. Oba polimery są sfunkcjonalizowane szybkimi lub wolnymi grupami reagującymi z tiolami.

• Szybkie grupy reagujące z tiolami na szkielecie polimeru szybko reagują z substancjami sieciującymi, tworząc hydrożele w ciągu kilku minut.
• Słabo reagujące grupy tiolowe na szkielecie polimeru reagują wolniej i wolniej tworzą hydrożele.

Polimery (PVA i dekstran) są obojętne i nie przylegają do komórek. Można je jednak sprzęgać z bioaktywnymi składnikami, takimi jak peptydy adhezyjne lub łączyć z białkami macierzy zewnątrzkomórkowej, aby umożliwić adhezję komórek i naśladować odpowiednie warunki fizjologiczne.

Sieciujące w TrueGel3D™ są również dwojakiego rodzaju. Nierozkładalny przez komórki środek sieciujący PEG składa się z glikolu polietylenowego z grupami tiolowymi (SH) na każdym końcu. Degradowalny przez komórki środek sieciujący CD jest podobny do niedegradowalnego przez komórki środka sieciującego PEG, ale zawiera sekwencje peptydowe, tworząc miejsca rozszczepienia dla metaloproteaz macierzy (MMP). Żele z CD-degradowalnym środkiem sieciującym umożliwiają komórkom rozprzestrzenianie się i migrację poprzez rozszczepianie sprzężonego peptydu, jeśli cząsteczki adhezji komórkowej są również składnikiem żelu.

Składniki TrueGel3D™	Chemia	Niedegradowalne	Degradowalny
Hydrożelowy polimer szkieletowy	Tiol-reactive	PVA nierozkładalny przez dekstranazę	Dekstran rozkładalny przez dekstranazę
Crosslinker	Funkcjonalizowany tiolem	PEG niezdegradowalny przez komórki	CD degradowalny przez komórkowe MMP

Zmienne wpływające na szybkość żelowania:

Powstawanie żelu zachodzi najlepiej przy równomolowym stężeniu (począwszy od 1,8 mmol/L) tiolu (środek sieciujący) i grup tiolowo-reaktywnych (polimer). Jednak sztywniejszy żel można utworzyć przy wyższym stężeniu tiolu i grup tiolowo-reaktywnych.

Ponadto szybkość reakcji jest również kontrolowana przez stężenie jonów wodorowych (pH). Przy niższym pH (środowisko kwaśne) zdeprotonowane aniony tiolanowe reagują powoli z grupami tiolowo-reaktywnymi i spowalniają tworzenie sieci między polimerem a środkiem sieciującym. Dlatego bufory w zestawach (pH 5,5 i 7,2) można mieszać w celu wygenerowania pośredniego pH, aby pomóc w optymalizacji czasu żelowania. Oba bufory zawierają czerwień fenolową ułatwiającą monitorowanie pH.

Wideo: Bijące komórki mięśnia sercowego hodowane w syntetycznych hydrożelach TrueGel3D^™

Zawiesina świeżo przygotowanych komórek z embrionalnej tkanki serca kurcząt została osadzona w hydrożelu na bazie dekstranu zmodyfikowanym peptydem RGD i usieciowana za pomocą sieciującego metaloproteazy matrycy (TRUE1). Zagregowane komórki mięśnia sercowego są otoczone przez fibroblasty. Komórki mięśnia sercowego dzięki uprzejmości dr Udo Kraushaara (NMI Reutlingen, Electrophysiology Group, Niemcy).