Czynniki przyczepności dla trójwymiarowej hodowli komórek

Przegląd sekcji

• Czynniki przyczepności w trójwymiarowych (3D) matrycach
• Matryca zewnątrzkomórkowa
• Składniki macierzy zewnątrzkomórkowej
• Czynniki przyczepności ECM pośredniczą w powiązaniach komórka-komórka/komórka-ECM
• Kultury komórkowe 3D
• Przejście z dwu- do trójwymiarowych kultur komórkowych
• .Kultury 3D występują w różnych kształtach i rozmiarach
• Skład kultur 3D wpływa na zastosowania badawcze i wyniki
• Kultury 3D: Blok konstrukcyjny w inżynierii tkankowej

Attachment Factors in Three-dimensional (3D) Matrices: Aspekty w inżynierii tkankowej

Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórek oparte na macierzy zewnątrzkomórkowej są wykorzystywane jako narzędzia badawcze do zrozumienia normalnych i chorobowych systemów oraz do badań przesiewowych leków in vitro. W niniejszym artykule omówiono macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i jej składniki czynnika wiążącego w odniesieniu do ich funkcji w biologii strukturalnej i ich dostępności na rynku do zastosowań in vitro.

Macierz zewnątrzkomórkowa: Organizowanie komórek w tkanki

Wszystkie komórki zwierzęce są zorganizowane jako wysoce złożone wyspecjalizowane tkanki. Niezależnie od tego, czy tkanki są w stanie stałym, czy płynnym, komórki nie składają się z samej tkanki, ale są w stałym, bliskim kontakcie ze środowiskiem macierzy zewnątrzkomórkowej. Komórki wydzielają różne rodzaje białek, które tworzą interkalowaną siatkę obejmującą wyspecjalizowaną tkankę ECM.

Ogólnie rzecz biorąc, funkcja ECM jest ważna dla:

• Fenotypu tkanki
• Stabilności mechanicznej tkanki
• Ruchliwości komórek
• Proliferacji, różnicowania i morfogenezy<
• Sygnał wewnątrz/ międzykomórkowy
• Naprawa tkanek

W ten sposób ECM odgrywa kluczową rolę w homeostazie tkanek, w stanach normalnych, patologicznych i złośliwych.

Składniki macierzy zewnątrzkomórkowej: Utrzymywanie kontaktu

Ogólnie rzecz biorąc, ECM składa się z nierozpuszczalnych włókien kolagenowych i rozpuszczalnych białek. Różne składniki ECM mają identyczne moduły struktury/funkcji, są ze sobą połączone, a niektóre z nich mają zdolność do łączenia się ze składnikami powierzchni komórek, stąd ich nazwa jako czynniki przywiązania. W ten sposób istnieje stałe funkcjonalne powiązanie między ECM a komórkami tkanek.

Opisy głównych składników ECM:

• Kolagen, wysoce zmienne białko, jest najbardziej rozpowszechnionym białkiem w królestwie zwierząt. Różne typy kolagenu tworzą sztywne włókna / dwuwymiarowe siateczki, dzięki czemu tkanki stałe są odporne na rozciąganie.
• Proteoglikany, które mają strukturę białka rdzeniowego przyłączonego do długich polisacharydów, takich jak kwas hialuronowy (HA), siarczan heparanu lub siarczan chondroityny. Struktura ta sprawia, że są one wysoce uwodnione, tworząc lepką objętość międzykomórkową, w której komórki mogą być ruchliwe podczas proliferacji/różnicowania. Niektóre formy tych wysoce zmiennych białek obejmują błony plazmatyczne i są związane z wewnątrzkomórkowymi składnikami sygnalizacyjnymi, tworząc krzyżową wymianę ECM-cytoplazma. Niektóre formy wiążą czynniki wzrostu i hormony, tworząc rezerwuary i umożliwiając ich prezentację/pozbawienie komórek tkanek.
• Multi-adhezyjne białka macierzy, które są interkalowane i oddziałują z kolagenem, błonami komórkowymi, polisacharydami, hormonami i czynnikami wzrostu. Dwa główne przykłady to laminina i fibronektyna. Oba są zmiennymi heterodimerami, czasami występującymi jako sieć białkowa, wiążącymi kolagen i inne składniki ECM, wraz z integrynami na powierzchni komórki. Fibronektyna osoczowa, znajdująca się w krwiobiegu, wraz z fibronektyną tkanek stałych jest związana z gojeniem się ran. Fibronektyna tkanki stałej umożliwia migrację komórek odpornościowych, a fibronektyna osocza uczestniczy w krzepnięciu poprzez połączenie z fibryną i integrynami na aktywowanych powierzchniach komórek płytkowych.

Z tych opisów jasno wynika, dlaczego zmiany w ECM mogą powodować zmiany w stanach patologicznych, takie jak zwiększenie zdolności komórek nowotworowych do przerzutów. ²

Czynniki przyczepności ECM pośredniczą w połączeniach komórka-komórka/komórka-ECM - ogniskowe adhezje

Jak wyjaśniono wcześniej, struktura i funkcja składników ECM tworzą skomplikowane sieci komórek i ECM, prowadząc do ciągłej wymiany informacji między wewnętrznym i zewnętrznym środowiskiem komórkowym. Obszary kontaktu między błoną plazmatyczną a ECM nazywane są zrostami ogniskowymi. Skład molekularny tych struktur różni się w zależności od tkanki, ale generalnie cząsteczki integryn na powierzchni komórki łączą się zarówno z wewnątrzkomórkowymi białkami związanymi z cytoszkieletem, jak i ze składnikami ECM (Rysunek 1). ECM jest jednostką funkcjonalną w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej.

Rysunek 1. Typowa struktura adhezji ogniskowej.

Kultury komórkowe 3D - "brakujące ogniwo"

Stało się jasne, że ECM nie jest jedynie fizycznym rusztowaniem utrzymującym komórki na miejscu w tkance. Poniżej przedstawiono przykłady ról odgrywanych przez czynniki wiążące na styku ECM-błona komórkowa w funkcjonowaniu komórek:

• Hepatocyty wymagające wyspecjalizowanego ECM podobnego do wątroby w celu ekspresji białek specyficznych dla tkanki.^4,5
• ECM działający jako rezerwuar hormonów i czynników wzrostu prezentujący lub wstrzymujący określone hormony i czynniki wzrostu w wyniku wyspecjalizowanych połączeń ECM-komórka.^1,6
• Dwukierunkowa wymiana między ECM a cytoplazmą, umożliwiająca stałą odpowiedź komórkową na warunki zewnątrzkomórkowe. Na przykład cząsteczka CD44 na powierzchni komórek limfocytów wchodzi w interakcje z kwasem hialuronowym, umożliwiając zainicjowanie mechanizmu "toczenia" prowadzącego do infiltracji tkanki limfocytów.⁷
• Ekosensoryczna tkanka łączna ulegająca przebudowie i wpływająca na komórki podczas morfogenezy embrionalnej i naprawy tkanek po urazie. ⁸

Przejście od dwu- do trójwymiarowych hodowli komórkowych

Badania ex-vivo/in-vitro badania z wykorzystaniem pierwotnych lub unieśmiertelnionych komórek są niewątpliwie wygodnym, stosunkowo tanim i niezawodnym sposobem pozyskiwania wstępnych informacji na temat różnych funkcji biologicznych. Jednakże hodowle in vitro są pod wieloma względami gorsze od badań in vivo. Jedną z obaw jest to, że hodowla komórek na dwuwymiarowych (2D) podłożach tworzy sztuczną polaryzację dolnej i górnej powierzchni, artefakt odzwierciedlony w wielu właściwościach fizjologicznych. Jednak badania in vivo są kosztowne, powolne i często stwarzają trudności w wyizolowaniu pojedynczego badanego procesu/mechanizmu.

Trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe opracowane w ciągu ostatnich lat okazały się pomostem między kulturami 2D a badaniami in vivo, łącząc w ten sposób wygodę kontrolowanego, stosunkowo taniego i szybkiego środowiska eksperymentalnego z niezawodnością fizjologiczną. Naukowcy mogą teraz kontrolować zarówno zawartość komórek, jak i macierzy, co pozwala naśladować różne tkanki i warunki fizjologiczne, zachowując jednocześnie strukturę podobną do tkanki komórek w kontekście ECM. Komórkami można manipulować w różny sposób przed ich hodowlą w matrycy 3D. Względna przezroczystość matrycy pozwala również na wizualizację procesów i struktur.⁹ Z tych powodów hodowle 3D zostały określone jako "tkanki inżynieryjne".

Kultury 3D występują w różnych kształtach i rozmiarach

Ogólnie rzecz biorąc, kultury komórkowe 3D zawierają pierwotne lub unieśmiertelnione komórki, naiwne lub zmanipulowane, wysiane na, pod lub wewnątrz matrycy opartej na ECM. Następnie można przygotować wyspecjalizowane matryce ECM pochodzące z komórek/tkanek, ponieważ ECM jest wydzielany z komórek in vivo.¹⁰

Główne czynniki adhezyjne i składniki ECM są również dostępne na rynku, aby pomóc w przygotowaniu określonych tkanek inżynierskich, takich jak następujące:

• czynniki mocujące ECM do naczyń do hodowli tkankowych - Następujące czynniki mocujące mogą być stosowane jako pojedynczy składnik macierzy lub w kombinacjach: laminina, kolagen, agrekan, fibronektyna, vitronektyna i kwas hialuronowy.
• Biomateriały ECM - żele ECM izolowane ze źródeł takich jak guzy (Nr produktu. L2020, ECM bogaty w lamininę i Nr produktu E1270, żel ECM).
• Biomateriały rusztowań - niektóre biopolimery mogą być stosowane w połączeniu ze składnikami ECM w celu zapewnienia struktury 3D i dokładnej funkcji fizjologicznej w komórkach hodowlanych, jak pokazano w przypadku różnych komórek nowotworowych.¹¹ (Ultra-Web^® syntetyczne podłoża nanofibrylarne 3D in vivo-like firmy Corning^®)

Skład kultury 3D wpływa na zastosowanie w badaniach & findings

Ostatnie postępy w rozwoju hodowli komórkowych 3D doprowadziły do uświadomienia sobie, że tkanki inżynieryjne są nie tylko cennym narzędziem do naśladowania warunków tkankowych in vivo, ale ich struktura fizyczna i skład czynnika przywiązania mają kluczowe znaczenie dla tego zachowania.

Poniżej znajdują się przykłady tego, jak wydajność tkanek 3D zależy od ECM i składu czynnika przyczepności:

• Zainżynierowane guzy zachowują się inaczej z dodatkami ECM i bez nich.¹¹ Guzy pochodzące od ludzi zostały utworzone na rusztowaniach 3D z poli (laktydu-co-glikolidu) (PLG). W eksperymencie guzy wysiano na samym PLG, PLG w połączeniu z ECM bogatym w lamininę oraz na kulturach 2D. Każdy z nich został porównany pod kątem wydajności in vivo pod względem proliferacji, angiogenezy, profilu hipoksji i reaktywności na chemioterapię. Połączenie struktury 3D PLG i bogatego w lamininę ECM dało agresywne guzy o zmniejszonej wrażliwości na leki, które najlepiej przypominały guzy in vivo.
• Żele ECM bogate w lamininę różnicują guzy łagodne i złośliwe.^12,13 Matryca żelowa ECM wzbogacona lamininą pozwala na różnicowanie guzów łagodnych i złośliwych na podstawie morfologii i proliferacji komórek. Ma to oczywiście potencjalne zastosowanie w diagnostyce klinicznej.
• Scieżki sygnałowe ściśle przypominają sieci in vivo na określonej matrycy ECM.¹⁴ Praca ta wykazała wykorzystanie żelu podobnego do błony podstawnej (ECM leżącego u podstaw nabłonka) jako matrycy umożliwiającej identyfikację szlaków sygnałowych, które, gdy są manipulowane zgodnie, mogą prowadzić do przywrócenia morfologicznie normalnych struktur piersi lub do śmierci komórek nowotworowych o wysokim stopniu przerzutów. Podejście to ma potencjalne zastosowanie w projektowaniu strategii interwencji terapeutycznych dla agresywnych nowotworów piersi.
• Kolagenowe kultury 3D upraszczają fizjologiczne badania genomiczne. Wykazano, że matryca kolagenowa 3D umożliwia fizjologiczną proliferację i kurczenie się komórek mięśni gładkich, czemu towarzyszą odpowiednie wzorce ekspresji genetycznej.¹⁵ Kultury 3D mogą zawierać genetycznie zmanipulowane komórki (za pomocą siRNA, infekcji itp.) i mogą być stosunkowo łatwe do analizy pod kątem ekspresji genów i właściwości fizjologicznych. W związku z tym, niektóre tkanki inżynierii 3D mogą pozwolić na badania z zakresu genetyki fizycznej w celu:
  
  
  1. pominięcia potrzeby transgenicznych zwierząt i rozbudowanych protokołów hodowlanych
  2. badania funkcji genów na wielu genetycznych podstawach.

• Zarówno struktura, jak i skład matryc 3D są wymagane dla funkcjonalnych zrostów ogniskowych.¹⁶ Praca ta dostarczyła przekonujących dowodów na to, że zarówno struktura przestrzenna, jak i skład czynników adhezyjnych matrycy 3D wpływa na zdolność zarówno ogniskowych adhezji, jak i biologii komórek do przypominania tych występujących in vivo pod względem sygnalizacji związanej z adhezją ogniskową, morfologii, adhezji, ruchu i proliferacji.

Kultury 3D: Budulec w inżynierii tkankowej

Badania doprowadziły do optymalnych warunków dla pracy in vitro/ex vivo z kulturami komórkowymi. Rosnący dylemat związany z komplikacjami protokołów in vivo z jednej strony i artefaktami pochodzącymi z in vitro z drugiej strony spowodował potrzebę stworzenia platformy badawczej, która byłaby niezawodna, przypominała warunki in vivo i umożliwiała szybkie badania w kontrolowanych warunkach. Dzięki doskonałym badaniom akademickim i klinicznym oraz szybkiej reakcji branży nauk przyrodniczych istnieją obecnie najnowocześniejsze modele do hodowli komórek w trójwymiarowych tkankach inżynierskich. Chociaż niektóre typy tkanek nie zostały jeszcze z powodzeniem odtworzone in vitro i nie można w pełni naśladować złożonych typów komórek i procesów interkalowanych in vivo, inżynierskie tkanki 3D mają potencjał w diagnostyce klinicznej i leczeniu.

Referencje

1. Lodish H, Berk A, Zipursky, SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. 2000. Molecular Cell Biology. 4th Edition. New York: WH Freeman and Co..

2. Mousa SA. 2008. Cell Adhesion Molecules: Potential Therapeutic & Diagnostic Implications. Mol Biotechnol. 38(1):33-40. https://doi.org/10.1007/s12033-007-0072-7

3. CHAFFEY N. 2003. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. and Walter, P. Molecular biology of the cell. 4th edn.. 91(3):401-401. https://doi.org/10.1093/aob/mcg023

4. Wu, X. Z. and Chen, D.. 2006. Minerva Gastroenterol. Dietol. 52: 407-13..

5. Sato M, Suzuki S, Senoo H. 2003. Hepatic Stellate Cells: Unique Characteristics in Cell Biology and Phenotype. Cell Struct. Funct.. 28(2):105-112. https://doi.org/10.1247/csf.28.105

6. Powers CJ, McLeskey SW, Wellstein A. 2000. Fibroblast growth factors, their receptors and signaling..165-197. https://doi.org/10.1677/erc.0.0070165

7. Clark RA, Alon R, Springer TA. 1996. CD44 and hyaluronan-dependent rolling interactions of lymphocytes on tonsillar stroma.. 134(4):1075-1087. https://doi.org/10.1083/jcb.134.4.1075

8. Daley WP, Peters SB, Larsen M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. Journal of Cell Science. 121(3):255-264. https://doi.org/10.1242/jcs.006064

9. Petersen MC, Lazar J, Jacob HJ, Wakatsuki T. 2007. Tissue engineering: a new frontier in physiological genomics. Physiological Genomics. 32(1):28-32. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00165.2007

10. Beacham DA, Amatangelo MD, Cukierman E. 2006. Preparation of Extracellular Matrices Produced by Cultured and Primary Fibroblasts. Current Protocols in Cell Biology. 33(1):10.9.1-10.9.21. https://doi.org/10.1002/0471143030.cb1009s33

11. Fischbach C, Chen R, Matsumoto T, Schmelzle T, Brugge JS, Polverini PJ, Mooney DJ. 2007. Engineering tumors with 3D scaffolds. Nat Methods. 4(10):855-860. https://doi.org/10.1038/nmeth1085

12. Lee GY, Kenny PA, Lee EH, Bissell MJ. 2007. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat Methods. 4(4):359-365. https://doi.org/10.1038/nmeth1015

13. Peterson, O. W. et. al. . 2003. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 1943-8..

14. Wang F, Hansen RK, Radisky D, Yoneda T, Barcellos-Hoff MH, Petersen OW, Turley EA, Bissell MJ. 2002. Phenotypic Reversion or Death of Cancer Cells by Altering Signaling Pathways in Three-Dimensional Contexts. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 94(19):1494-1503. https://doi.org/10.1093/jnci/94.19.1494

15. Li S, Lao J, Chen BP, Li Y, Zhao Y, Chu J, Chen K, Tsou T, Peck K, Chien S. 2003. Genomic analysis of smooth muscle cells in three?dimensional collagen matrix. FASEB j.. 17(1):97-99. https://doi.org/10.1096/fj.02-0256fje

16. Cukierman E. 2001. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. 294(5547):1708-1712. https://doi.org/10.1126/science.1064829