Często zadawane pytania dotyczące kultury organoidalnej
- Czym są organoidy?
- Czym jest biobank organoidów?
- Jaka jest różnica między organoidami a sferoidami?
- Jak generowane są organoidy?
- Jakie są zalety/wady iPSC vs PDO?
- Jak organoidy nowotworowe są wykorzystywane w badaniach nad rakiem?
- Jak hodowane są organoidy?
- Czy Matrigel jest wymagany do hodowli organoidów?
- Czym są kopuły Matrigel?
- Jak usunąć Matrigel z hodowli organoidów?
- Jakie media lub suplementy są wymagane dla organoidów?
- Jak długo organoidy mogą być ekspandowane w hodowli?
- Jak pasażować organoidy?
- Czy można zamrażać lub kriokonserwować organoidy?
- Jak wybarwić organoidy przeciwciałami?
- Jak wyodrębnić RNA/DNA z organoidów hodowanych w Matrigelu?
- Czy wymagane są specjalistyczne testy dla organoidów?
- Jak przeprowadzić test toksyczności komórek przy użyciu organoidów?
- Jak zmniejszyć zmienność w kulturach organoidalnych?
- Gdzie mogę kupić etycznie pozyskiwane ludzkie organoidy?
Czym są organoidy?
Organoidy to złożone, wielokomórkowe, trójwymiarowe modele komórkowe in vitro wykorzystywane w badaniach biomedycznych, które ściśle naśladują organy in vivo. Hans Clevers, pionier biologii organoidów w Instytucie Hubrechta, po raz pierwszy wykazał w 2009 r., że pojedyncza komórka macierzysta jelita z ekspresją LGR5+ może samoorganizować się w struktury kryptowo-willusowe podobne do jelita dorosłego. Od tego czasu organoidy zostały uzyskane z wielu tkanek, w tym między innymi z mózgu, okrężnicy, nerek, wątroby, trzustki, płuc i biopsji nowotworów.

Rysunek 1a.Organoid jelitowy myszy.

Rysunek 1b.Ludzkie organoidy okrężnicy.

Rysunek 1c.Organoidy ludzkich płuc.
Co to jest biobank organoidów?
Aby sprostać spersonalizowanym medycznym zastosowaniom badawczym, biobanki ludzkich organoidów zostały wygenerowane z różnych tkanek zawierających szeroki zakres fenotypów komórkowych i molekularnych. Na przykład, utworzenie kolekcji normalnych i chorych organoidy żołądkowo-jelitowe pomogły w badaniach nad rakiem jelita grubego i innymi chorobami związanymi z układem pokarmowym, takimi jak choroba Leśniowskiego-Crohna, zespół jelita drażliwego (IBS) i wrzodziejące zapalenie jelita grubego.

Rysunek 2.Izolacja i kriokonserwacja organoidów pochodzących od pacjentów (PDO) może być wykorzystywana do tworzenia biobanków organoidów.
Organoidy
Sferoidy


- Pochodzące z komórek macierzystych lub tkanki pierwotnej
- Wiele typów komórek o złożonych strukturach
- Hodowane w hydrożelu (Matrigel)
- Wysokie znaczenie fizjologiczne dla badań przesiewowych leków
- Nieograniczona żywotność
- Pochodzące z unieśmiertelnionych linii komórkowych
- Jeden typ komórek o prostej strukturze
- Hodowane jako swobodnie unoszące się agregaty na płytkach o niskiej przyczepności
- Niższe znaczenie fizjologiczne (tj.gradient niedotlenienia)
- Ograniczona długość życia
Jak generowane są organoidy?
Organoidy mogą pochodzić z tkanek dorosłych, określanych jako organoidy pochodzące od pacjenta (PDO), lub z pluripotencjalnych komórek macierzystych (ludzkich ES/iPSC). Izolacja i ekspansja populacji komórek macierzystych LGR5+ ma kluczowe znaczenie dla utrzymania zdolności organoidów do samoodnowy. Inne czynniki krytyczne dla utrzymania organoidów w hodowli obejmują stosowanie kwalifikowanego do partii GFR Matrigel, przestrzeganie odpowiednich technik pasażowania i pozyskiwanie wysokiej jakości pożywek dla organoidów i odczynników do hodowli komórkowej.
Protokoły hodowli organoidów
Jakie są zalety/wady iPSC vs PDO? |
---|
Jak organoidy nowotworowe są wykorzystywane w badaniach nad rakiem?
Organoidy pochodzące od pacjentów mogą być tworzone zarówno z biopsji tkanek zdrowych, jak i nowotworowych. Wykazano, że organoidy guza (tumoroidy) zachowują kluczowe cechy genetyczne i fenotypowe swojej tkanki pochodzenia i podtypu guza, przy jednoczesnym zachowaniu heterogeniczności wewnątrz guza. Niedawno PDO guza zostały wykorzystane jako predyktor in vitro odpowiedzi na leczenie chemioterapeutyczne, wykazując znaczenie tych modeli w identyfikacji nowych metod leczenia przeciwnowotworowego poprzez badania przesiewowe leków.

Rysunek 3. Badanie przesiewowe leków przy użyciu organoidów 3dGRO™ ludzkiego raka jelita grubego (CRC).(A) Organoidy CRC rozmrożono i pozostawiono do regeneracji przez 48 godzin, a następnie miareczkowano trametynib wraz z kontrolą DMSO przez 5 dni. Organoidy zabarwiono następnie na markery jądrowe (niebieski) i cytoszkieletowe (czerwony) do obrazowania konfokalnego. (B) Żywotność organoidów w punkcie końcowym testu określono za pomocą CellTiter-Glo® 3D, aby wygenerować krzywe miareczkowania i wartości IC50. Słupki skali: 100 μm. CRC-A: ISO50 (SCC504), CRC-B: ISO68 (SCC506), CRC-C: ISO72 (SCC507).
Jak hodowane są organoidy?
Po wyizolowaniu organoidy są hodowane w specjalistycznych pożywkach osadzonych w bogatym w macierz zewnątrzkomórkową (ECM) hydrożelu z ekstraktem z błony podstawnej, takim jak Growth Factor Reduced Matrigel. Podłoże jest uzupełniane co drugi dzień, a komórki są pasażowane raz w tygodniu (7-12 dni), zanim komórki staną się zbyt duże lub nekrotyczne. Komórki mogą być pasażowane w małych fragmentach lub jako pojedyncze komórki przy użyciu mechanicznej dysocjacji/odczynników do pasażowania bez enzymów. W zależności od typu organoidu i konfluencji, podczas pasażowania organoidów można stosować proporcje podziału około 1:3-1:4. W przypadku wrażliwych typów organoidów, ROCKi (Y27632) (SCM075) można dodać podczas pasażowania, aby pomóc w promowaniu żywotności komórek.
Przewodnik po protokole PDO organoidów żołądkowo-jelitowych
Czy matrigel jest wymagany do hodowli organoidów?
Tak, Matrigel jest niezbędny do promowania prawidłowego wzrostu organoidów. Matryca Matrigel zapewnia niezbędne chemiczne cytokiny sygnalizacyjne i strukturalne białka ECM wymagane do naśladowania naturalnego środowiska 3D in vivo. Matrigel jest często używany w nierozcieńczonym formacie (8 mg/ml lub więcej) do tworzenia kopuł Matrigel używanych do hodowli organoidów. Ostatnio, hodowle organoidów w zawiesinie o wyższej wydajności zostały wygenerowane poprzez dodanie rozcieńczonego Matrigelu do pożywki, zamiast wykorzystywania kopuł Matrigelu.
Czym są kopuły Matrigelu?
Oparta na kopułach metoda hodowli organoidów obejmuje wysiewanie fragmentów organoidów w pojedynczej kropli Matrigel ECM i umożliwienie polimeryzacji. Gdy Matrigel ECM spolimeryzuje, pożywka jest dodawana do studzienki na górze kopuły. Jedna kopuła Matrigel jest zwykle wysiewana na studzienkę.



Rysunek 4. Technika hodowli organoidów w kopule z matrigelu.
Jak usunąć matrigel z hodowli organoidów?
Matrigel można usunąć podczas pasażowania poprzez wirowanie z prędkością 1100 obrotów na minutę przez 5 minut. Po odwirowaniu można ostrożnie odessać cienką warstwę matrigelu widoczną nad osadem komórek organoidalnych. Organoidy należy przemyć pożywką lub PBS i ponownie odwirować w celu usunięcia dodatkowego matrigelu. Dodatkowo, Corning® Cell Recovery Solution może być użyty do odzyskania organoidów z kopuł Matrigelu.
Jakie pożywki lub suplementy są wymagane dla organoidów?
Każdy typ komórek organoidalnych wymaga unikalnego zestawu pożywek bez surowicy. Powszechnie stosowane pożywki i suplementy obejmują zaawansowane DMEM/F12 (SCM162), N-2 (SCM012), N-27 (SCM013), Niacynamid, N-Acetylo-L-cysteina, Gastryna WNT, R-Spondin-1, Noggin, FGF, EGF lub małocząsteczkowe inhibitory, takie jak CHIR99021, SB202190 i A-83-01.
W celu obniżenia kosztów drogich białek rekombinowanych, L-WRN (WNT, R-Spondin, Noggin) (SCM105), R-Spondin-1 (SCM104) i pożywki kondycjonowane WNT zostały wykorzystane jako niedroga alternatywa dla rekombinowanych białek w celu uzupełnienia pożywek organoidalnych.
Jak długo organoidy mogą być ekspandowane w hodowli?
Większość organoidów może być ekspandowana w nieskończoność, jeśli populacja komórek macierzystych LGR5+ jest utrzymywana przy użyciu odpowiednich mediów i technik pasażowania. Zaleca się przeprowadzanie analizy ekspresji markerów i kariotypu co 5-10 pasaży w celu zapewnienia jakości i tożsamości organoidów.
Jak pasażować organoidy?
Organoidy mogą być pasażowane w małych fragmentach lub pojedynczych komórkach przy użyciu mechanicznej dysocjacji lub odczynników do pasażowania bez enzymów.
Czy można zamrażać lub kriokonserwować organoidy?
Tak. W zależności od typu komórek organoidalnych, zoptymalizowane podłoże do zamrażania komórek organoidalnych (SCM301) może być używane do kriokonserwacji organoidów. Wiele typów organoidów pochodzących od pacjentów można poddać kriokonserwacji. Jednak niektóre typy dojrzałych komórek organoidalnych pochodzących z iPSC, takie jak organoidy płuc, nie mogą być z powodzeniem zamrażane. Przed zamrożeniem organoidy należy poddać wstępnej obróbce za pomocą ROCKi (Y27632) (SCM075), aby zwiększyć żywotność komórek. Zalecamy zamrożenie 5-10 kopuł Matrigel w 1 fiolce przy użyciu kontrolowanego pojemnika do zamrażania Mr. Frosty. Średnia gęstość organoidów w każdej kopule powinna wynosić ~90% w momencie zamrażania, aby zapewnić najwyższą żywotność komórek.
Jak barwić organoidy przeciwciałami?
Organoidy mogą być barwione przeciwciałami do analizy immunocytochemicznej (ICC)/immunohistochemicznej (IHC) przy użyciu technik całego montażu lub zatapiania/skrawania parafinowego. Kluczowe jest stosowanie przeciwciał wstępnie zakwalifikowanych do analizy organoidów.
Przewodnik po protokole: Immunofluorescent Staining of Whole-Mount Organoids using Antibodies
Organy okrężnicy
Organy płuc


Rysunek 5. Barwienie przeciwciałami organoidów. Organy okrężnicy i płuc barwione przeciwciałami związanymi z SARS-Cov2 (ACE2 i TMPRSS2).
Jak wyodrębnić RNA/DNA z organoidów hodowanych w matrigelu?
Tradycyjne Zestawy do izolacji DNA/RNA mogą być używane do przygotowania materiału genomowego do sekwencjonowania (RNA-seq, scRNA-seq, WGS, CHIP-seq itp.). W przypadku niektórych zastosowań z dużymi organoidami zalecane są zestawy do ekstrakcji DNA/RNA specyficzne dla tkanki. Odczynnik TRI (T9424) może być dodany do zdysocjowanych organoidów przed ekstrakcją RNA i może być przechowywany w temperaturze -80 °C do czasu przyszłego użycia.
Czy wymagane są specjalistyczne testy dla organoidów?
Ze względu na zmienny charakter organoidów, większość tradycyjnych testów wymaga dalszej optymalizacji eksperymentalnej. Na przykład powszechny test żywotności martwych komórek (CBA415) został zoptymalizowany pod kątem hodowli 3D, w tym organoidów. Test opiera się na Calcein-AM (żywe komórki), jodku propidium (martwe komórki) i Hoechst 33342 (wszystkie komórki). Innym popularnym testem organoidów jest Forskolin-Induced Organoid Swelling Assay, który mierzy funkcję CFTR.

Rysunek 6. Ludzkie organoidy okrężnicy pochodzące z iPSC wybarwione zestawem do oznaczania żywotności martwych komórek.Górny rząd przedstawia żywe kultury wybarwione Calcein-AM (A), jodkiem propidium (B), Hoechst 33342 (C) i połączony obraz jasnego pola (D). Dolny panel obrazów (E-H) przedstawia organoidy utrwalone 70% etanolem, a następnie wybarwione Calcein-AM (E), jodkiem propidyny (F), Hoechst 33342 (G) i połączony obraz jasnego pola (H).
Jak przeprowadzić test toksyczności komórkowej przy użyciu organoidów?
W celu analizy cytotoksycznego działania związków farmakologicznych, testy oparte na lucyferazie, które mierzą ATP, takie jak Cell Viability Luciferase Assay (SCT149) lub CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assays są często stosowane w hodowlach organoidalnych.

Rysunek 7. Testowanie cytotoksyczności flawopiridolu przy użyciu ludzkich organoidów okrężnicy.100 µM flawopirydolu powoduje cytotoksyczne działanie na ludzkie organoidy okrężnicy analizowane przy użyciu testu CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay.
Jak zmniejszyć zmienność w hodowlach organoidalnych?
Niektóre typy komórek organoidalnych, takie jak ludzkie organoidy okrężnicy, mogą być pasażowane pojedynczymi komórkami przy użyciu odczynników dysocjacyjnych TrypLE Express. Posiew równoważnej liczby organoidów na studzienkę daje bardziej jednorodne hodowle organoidów niż tradycyjne mechaniczne lub enzymatyczne techniki pasażowania kępek. W przypadku pasażowania pojedynczych komórek, krytyczne znaczenie ma dodanie ROCKi Y27632 (SCM075) w końcowym stężeniu 10 μM do pożywki w celu utrzymania żywotności komórek. Inną techniką zmniejszania zmienności testów jest ręczne usuwanie organoidów o nieprawidłowej morfologii przy jednoczesnym zachowaniu organoidów o podobnych rozmiarach.
Gdzie mogę kupić etycznie pozyskiwane ludzkie organoidy?
Oferujemy kolekcje etycznie pozyskiwanych wysokiej jakości organoidów PDO układu pokarmowego, jak również iPSC pochodzące z Colon i organoidy płuc.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?