Przewodnik po protokole: Barwienie immunofluorescencyjne organoidów w całości przy użyciu przeciwciał

Organoidy mają złożone trójwymiarowe struktury i są osadzone w hydrożelach ECM co utrudnia ich charakterystykę. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) organoidów za pomocą przeciwciał można przeprowadzić w celu wizualizacji molekularnych markerów zachowania komórkowego, proliferacji, różnicowania, zdrowia i tożsamości komórek. Barwienie immunologiczne "whole-mount" jest przeznaczone dla małych fragmentów tkanek bez konieczności ich sekcjonowania, a metody są bardzo podobne do immunocytochemii (ICC) lub immunohistochemii (IHC) barwienia kriosekcji. Barwienie organoidów w całości może być stosowane do charakterystyki opartej na przeciwciałach. W tym protokole barwienia organoidów szczegółowo opisujemy metody utrwalania, permeabilizacji i barwienia organoidów całego montażu do analizy za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej.

Rysunek 1. Immunofluorescencja organoidów przy użyciu przeciwciał. Ludzkie organoidy nabłonkowe jelit i płuc barwione przeciwciałami dla acetylo-α-tubuliny (A), α-anhydrazy węglanowej IV (B) i Sox-9 (AB5535) (C).

Protokół barwienia organoidów

1. Usuń pożywkę z hodowli organoidów i delikatnie przemyj 2-krotnie 1-krotnym PBS (D8537).
2. Utrwalić 30-40 organoidów Matrigel w naczyniu 10 cm z 15-20 ml 4% PFA (1.00496) przez 30-60 minut w temperaturze pokojowej.  
   Uwaga: Matrigel częściowo rozpuści się po utrwaleniu w PFA. 
3. Od czasu do czasu obracaj naczyniem, aby oddzielić kopuły Matrigelu i uwolnić organoidy z Matrigelu.Uwaga: nie wszystkie organoidy zostaną uwolnione z Matrigelu.
4. Wlej 15-20 ml utrwalacza z naczynia 10 cm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i pozwól organoidom osiąść na dnie probówki grawitacyjnie (~ 10-15 minut).Gdy organoidy opadną na dno probówki stożkowej o pojemności 50 ml, ostrożnie odessać utrwalacz, starając się uniknąć zasysania osadu organoidów.
5. Dodaj 15-20 ml 1X PBS (D8537) do naczynia z kroku 4 i pozostaw na 15-20 minut w temperaturze pokojowej.
6. Po upływie 15-20 minut, obróć naczynie, aby oddzielić kopuły Matrigel i wlej 1X PBS (D8537) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej osad organoidów z kroku 5.
7. Powtórz kroki 5-7 jeszcze trzy razy.
8. Odpowietrz roztwór bez uszkadzania osadu organoidów i dodaj 5 ml 1X PBS (D8537) dozując z boku 50 ml probówki stożkowej zawierającej osad organoidów i zawiruj probówkę, aby ponownie zawiesić osad organoidów.  
   Uwaga: nie pipetuj w górę i w dół pipetą. Spowoduje to rozbicie większości organoidów.
9.  Bezpośrednio wlej 5 ml 1X PBS (D8537) zawierającego grudki organoidów do 10 cm naczynia zawierającego nieodłączone kopuły organoidów Matrigel.
10. Dodaj kolejne 5 ml 1X PBS (D8537) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, aby zebrać jak najwięcej grudek organoidów i bezpośrednio wlej je do 10 cm naczynia z organoidami.
11. Jeśli nie zostanie użyty natychmiast, zamknij naczynie 10 cm folią parafilmową i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
12. Gdy będziesz gotowy do wykonania barwienia immunofluorescencyjnego, wyjmij naczynie 10 cm zawierające utrwalone organoidy z lodówki i obserwuj je pod mikroskopem.
13. Odetnij końcówkę pipety o pojemności 1 ml tak, aby jej cylinder był wystarczająco duży do zassania organoidów bez ich ścinania lub łamania.
14. Przenieś organoidy (1-4) do 8-dołkowego szkiełka komorowego i usuń resztki 1X PBS (D8537) za pomocą pipety P-200.  Unikaj zasysania organoidów i ścinania ich przez nieobciętą końcówkę P-200.
15. Permeabilizuj utrwalone organoidy za pomocą 0,5 ml buforu blokującego (5% surowica końska + 0.5% Triton X-100 w 1X PBS) przez noc w temperaturze 4 °C lub 2-4 godziny w temperaturze pokojowej.  Uwaga: zaleca się stosowanie surowicy z tego samego gatunku, co gospodarz przeciwciała drugorzędowego.
16. Usuń bufor blokujący ze szkiełka komorowego zawierającego organoidy za pomocą pipety P-200.  Unikaj pipetowania organoidów przez końcówkę P-200.
17. Przygotuj pierwotne przeciwciała  (300-500 µL) lub bezpośrednie sprzężone przeciwciała  (300-500 µL) w buforze blokującym.
18. Dodaj rozcieńczone przeciwciała do odpowiednio oznakowanej studzienki zawierającej organoidy.
19. Pozostaw do inkubacji w temperaturze 4 °C przez noc.
20. Następnego dnia przepłukać 3-krotnie 1-krotnym PBS (D8537) przez 10-15 minut każdego płukania. Uwaga: W przypadku stosowania bezpośrednio sprzężonych przeciwciał próbki są gotowe do obrazowania w mikroskopie konfokalnym.
21. Jeśli używasz niesprzężonych przeciwciał pierwszorzędowych, przygotuj przeciwciała drugorzędowe  (300-500 µL) w buforze blokującym i do odpowiednio oznakowanych próbek.
22. Pozostawić do wybarwienia przeciwciałem drugorzędowym na noc w temperaturze 4°C.
23. Następnego dnia przepłukać 3-krotnie 1X PBS (D8537) przez 10-15 minut każdego płukania.
24. Usuń bufor blokujący z każdej studzienki zawierającej organoidy za pomocą pipety P-200; Unikaj pipetowania organoidów przez końcówkę P-200.
25. Przygotuj barwienie jądrowe dodając DAPI (D9542) w stężeniu 5 µg/ml w 1X PBS (300-500 µl na próbkę).
26. Dodaj roztwór barwiący DAPI do każdej próbki i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut.
27. Płukać 3 razy 1X PBS (D8537) przez 10-15 minut każdego płukania.
28. Próbki są gotowe do obrazowania na mikroskopie konfokalnym.