Test tworzenia sferoidów guza

Badania nad nowotworami są jedną z głównych dziedzin badawczych, w których każdego roku ukazują się tysiące publikacji. Tradycyjne podejścia terapeutyczne mają na celu wyeliminowanie jak największej ilości masy guza za pomocą chirurgii, napromieniania, chemioterapii i leków biologicznych. Jednak dowody sugerują, że techniki te nie są ukierunkowane na źródło choroby: nowotworowe komórki macierzyste (CSC) subpopulacja w obrębie guza.¹ Nowotworowe komórki macierzyste zostały zidentyfikowane w różnych nowotworach, w tym w nowotworach układu krwiotwórczego i wielu guzach litych.⁵ CSC są definiowane jako niewielki podzbiór złośliwych komórek w obrębie guza z wyłączną zdolnością do samoodnawiania i utrzymywania właściwości komórek macierzystych. Mogą one różnicować się w heterogeniczną masę zarówno nienowotworowych, jak i nowotworowych typów komórek i unikać tradycyjnej chemioterapii oraz prowadzić do regresji raka i przerzutów.³

Złotym standardem funkcjonalnego in vivo testu dla CSCs jest seryjna transplantacja wyizolowanych pojedynczych komórek nowotworowych do myszy z obniżoną odpornością (tj. myszy NOD SCID). Metoda ta wymaga jednak długich protokołów, a wyniki są często trudne do interpretacji. Test tworzenia sferoidów in vitro obejmuje metody generowania jednostek tworzących kolonie (CFU) zarówno w pożywkach półstałych, jak i w postaci trójwymiarowych agregatów guza. Wydajność tworzenia sfery guza (test TFE) wskazuje odsetek komórek w hodowli komórek nowotworowych, które są zdolne do utworzenia sfery z pojedynczej komórki. Wartości TFE są ilościowym pomiarem ilości komórek macierzystych raka w guzie/linii komórek rakowych i są skorelowane z przerzutami i agresywnością raka.

PromoCell 3D Tumorsphere Media XF (C-28070, C-28075) jest przeznaczony do seryjnego pasażowania nowotworowych komórek macierzystych w postaci niezróżnicowanych guzosfer 3D o wysokim współczynniku proliferacji komórek. Jego zdefiniowana i pozbawiona surowicy formuła umożliwia spójną i znormalizowaną ekspansję sferoidów przy jednoczesnym zachowaniu cech charakterystycznych dla nowotworowych komórek macierzystych, takich jak samoodnowa i chemiooporność. Wykazano, że pożywka wspiera hodowle komórek sferoidalnych z następujących linii komórkowych: U-87 MG, MCF-7, MDA-MB-231, HT-29, HT1080HepG2, A549, Panc-1, LNCaP i A431.

Rysunek 1. Hipoteza nowotworowych komórek macierzystych. Test tworzenia sferoidów in vitro jest powszechnym testem stosowanym do pomiaru samoodnowy i multipotencjalnego charakteru subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych w obrębie guza lub linii komórek nowotworowych.

Protokół testu tworzenia sferoid

Rysunek 2. Przegląd protokołu testu tworzenia sferoidów.

1. Zebrać kule nowotworowe.  Przenieść kule nowotworowe do probówki stożkowej o pojemności 15 ml.
2.   Pozostawić kule do sedymentacji grawitacyjnej na 10 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, pozostawiając około 200 µl w probówce stożkowej. Nie aspirować sfer nowotworowych.
3. Umyć sfery nowotworowe.Powtórz Grawitacyjną sedymentację sfer nowotworowych krok drugi z równą objętością PBS (D8537). Delikatnie wymieszaj PBS i pozostaw 200 µL w probówce stożkowej.
4. Trawienie enzymatyczne sfer nowotworowych.Dodaj 1 ml trypsyny-EDTA (T3924) do sfer nowotworowych i inkubuj przez 2-4 minuty w temperaturze pokojowej. Pipetuj w górę i w dół co 30 sekund, aby uniknąć sedymentacji. Niektóre komórki wymagają dłuższego okresu inkubacji.
5. Rozbij kule nowotworowe. Pipetuj w górę i w dół 10-20 razy za pomocą p-1000, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Dodaj podwójną objętość roztworu neutralizującego trypsynę (T6414).
6. Określ żywotność komórek.Przygotuj 5 ml świeżej pożywki 3D Tumorsphere Medium XF (C-28070, C-28075) i określ liczbę komórek oraz ich żywotność. Wirować komórki przez 5 minut z prędkością 300 x g. Przepuścić komórki przez filtr 40 µm, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek, a następnie określić liczbę komórek.
7. Rozcieńczyć zawiesinę pojedynczych komórek. Rozcieńczyć porcję zawiesiny pojedynczych komórek w świeżej pożywce, aby uzyskać 10 żywych komórek/ml (przygotować co najmniej 50 ml pożywki).
8. Płytki z pojedynczymi komórkami (dzień 0).  Rozprowadzić 100 µL zawiesiny pojedynczych komórek z kroku 7 do każdej studzienki 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U. Posiej 3-5 całych płytek.
9. Pozwól kulkom nowotworowym rosnąć. Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.
10. Dodaj świeżą pożywkę (dzień 4-6).  W dniu 4-6 dodaj 100 µL świeżej pożywki do każdej studzienki. Nie zmieniaj pożywki, tylko dodaj do istniejącej pożywki.
11. Ocena (dzień 7-12).  Sprawdź dołki płytki 96-dołkowej pod kątem tworzenia się kulek. Policz liczbę kulek i podziel przez całkowitą liczbę studzienek, a następnie pomnóż przez 100, aby określić TFE.

Uwaga: Zaleca się użycie średniej średnicy agregatu komórek jako parametru odczytu przy użyciu siatki mikroskopowej lub linijki. W idealnym przypadku mediana średnicy kuli określonej linii komórkowej jest już znana z poprzednich eksperymentów. Na przykład, komórki MCF-7 wykazują średnią średnicę > 150 µM po 10-12 dniach. Agregaty z < 80 µM nigdy nie powinny być liczone jako pozytywne. Niektóre wolno rosnące linie komórkowe wymagają więcej niż 7-12 dni wzrostu, aby osiągnąć wystarczająco duże sferoidy do oceny ilościowej.

Wyniki

Rysunek 3. Oczekiwane wyniki testu tworzenia sferoidów in vitro. A) Pozytywna sfera nowotworowa pochodząca z pojedynczej komórki MCF-7 o wielkości większej niż 150 µm. B) Negatywna sfera nowotworowa pochodząca z pojedynczej komórki MCF-7 mniejszej niż 150 µm.

Rysunek 4. Hodowla komórek raka piersi MCF-7 w podłożu PromoCell 3D Tumorsphere Media XF po 10 pasażach. Hodowlę guzosfer poddawano seryjnemu pasażowaniu co 9 dni poprzez enzymatyczną dysocjację zgodnie z protokołem. Podczas hodowli seryjnej utrzymywano stabilne tworzenie się guzosfery

Referencje

1. Hajdu SI. 2011. A note from history: Landmarks in history of cancer, part 1. Cancer. 117(5):1097-1102. https://doi.org/10.1002/cncr.25553

2. Tu S. 2013. Cancer: a ?stem-cell? disease?. Cancer Cell International. 13(1):40. https://doi.org/10.1186/1475-2867-13-40

3. Pierce, G.B. and F.J. Dixon . 1959. Testicular teratomas Demonstration of teratogenesis by metamorphosis of multipotential cells. . Cancer. 12(3).p. 573-83..

4. Bonnet D, Dick JE. 1997. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3(7):730-737. https://doi.org/10.1038/nm0797-730

5. Jordan CT. 2004. Cancer stem cell biology: from leukemia to solid tumors. Current Opinion in Cell Biology. 16(6):708-712. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2004.09.002

6. Clarke MF, Dick JE, Dirks PB, Eaves CJ, Jamieson CH, Jones DL, Visvader J, Weissman IL, Wahl GM. 2006. Cancer Stem Cells?Perspectives on Current Status and Future Directions: AACR Workshop on Cancer Stem Cells. Cancer Res. 66(19):9339-9344. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-06-3126

7. Lamb R, Ozsvari B, Lisanti CL, Tanowitz HB, Howell A, Martinez-Outschoorn UE, Sotgia F, Lisanti MP. 2015. Antibiotics that target mitochondria effectively eradicate cancer stem cells, across multiple tumor types: Treating cancer like an infectious disease. Oncotarget. 6(7):4569-4584. https://doi.org/10.18632/oncotarget.3174