Protokoły Northern i Southern Blot

Protokół Southern Blotting
Protokół Northern Blotting

Czym są Northern & Southern Blotting?

Przenoszenie makrocząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe i białka, na nośnik membranowy w fazie stałej jest znane jako blotting. Fragmenty cząsteczek DNA i RNA rozdzielone za pomocą elektroforezy żelowej są przenoszone na membranę nylonową lub nitrocelulozową w procesie określanym odpowiednio jako Southern i Northern blotting. Southern blotting został wprowadzony przez Edwina Southerna w 1975 roku jako metoda wykrywania określonych sekwencji DNA w próbkach DNA. Inne techniki blottingu wyłonione z tej metody zostały określone jako Northern (dla RNA), Western (dla białek), Eastern (dla potranslacyjnych modyfikacji białek) i Southwestern (dla interakcji DNA-białko).

Protokoły Southern i Northern blotting obejmują następujące główne etapy:

• Oczyszczanie DNA/RNA:  Ekstrakcja i oczyszczanie DNA/RNA z komórek lub źródeł tkankowych.
• Trawienie DNA: Trawienie DNA na fragmenty za pomocą enzymów restrykcyjnych. Ten krok nie jest wymagany dla RNA.
• Elektroforeza żelowa: Oddziel fragmenty DNA na żelu agarozowym. Próbki RNA można rozdzielić na żelu agarozowym z formaldehydem jako środkiem denaturującym, który ogranicza drugorzędowe struktury cząsteczek RNA.
• Transfer: Przenieś fragmenty DNA/RNA z żelu na nylonową membranę.
• Prehybrydyzacja (blokowanie):  Umyj membranę nylonową roztworem do prehybrydyzacji zawierającym DNA spermy łososia, aby zablokować niespecyficzne interakcje DNA i zmniejszyć szum tła. Alternatywnie, użyj buforu PerfectHyb™ Plus, który nie wymaga DNA spermy łososia do blokowania.
• Przygotowanie sondy: Przygotuj świeże DNA sondy i znakuj za pomocą ³²P alfa znakowanego dCTP.
• Hybrydyzacja:  Inkubuj blot z wyznakowaną sondą.
• Wykrywanie sondy: Wykryj sondę i sekwencję DNA/RNA będącą przedmiotem zainteresowania poprzez ekspozycję na film w temperaturze -80 °C.

Rysunek 1. Kroki związane z procedurą blottingu DNA/RNA

Protokół Southern Blotting

Wymagane materiały

• Odczynniki do izolacji i oczyszczania DNA
  
• Odczynniki do trawienia restrykcyjnego DNA
  
• Odczynniki i bufory do elektroforezy w żelu agarozowym
  
• Aparatura do elektroforezy w żelu agarozowym
  
• Bibuła filtracyjna Watmana
  
• Ręczniki papierowe
  
• Membrana nylonowa naładowana dodatnio
  
• DNA plemników łososia
  
• Rurka hybrydyzacyjna
  
• Filmy rentgenowskie
  
  

Wymagane bufory

• 10X TBE (93290), używany podczas elektroforezy żelowej. Bufor TAE (65497) może być użyty zamiast TBE dla większych fragmentów DNA. Alternatywnie można użyć buforu Bionic™ (B6185) zamiast TAE lub TBE, aby uzyskać ostrzejsze prążki w krótszym czasie. Bufor 10X TBE można przygotować z następujących odczynników:
  
  TRIS 1.3 M
  Kwas borowy 450 mM
  EDTA 25 mM
  
  
• 20X SSPE (S2015), używany jako bufor do wstępnej hybrydyzacji i transferu. 20X SSC (93017) może być używany zamiast SSPE w podobnych protokołach blottingu. Alternatywnie można przygotować 20-krotny roztwór SSPE z następujących odczynników:
  
  NaCl 2,98 M
  EDTA 0,02 M
  Bufor fosforanowy (pH 7,4) 0.2M
  
  
• Roztwór denaturujący (N1531), używany do denaturacji dsDNA, czyniąc go dostępnym dla sondy. Alternatywnie można przygotować 1X roztwór denaturujący z następujących odczynników:
  
  NaCl 1,5 M
  NaOH (S5881) 0.5 N
  Dostosuj pH do ~13
  
  
• Roztwór neutralizujący (N6019), używany do neutralizacji żelu po denaturacji dsDNA. Alternatywnie można przygotować 1X roztwór neutralizujący z następujących odczynników:
  
  NaCl 1,5 M
  TRIS HCl 1 M
  Dostosuj pH do 7.5
  
  
• *Roztwór Denhardta (D2532), używany podczas prehybrydyzacji do blokowania niespecyficznej hybrydyzacji DNA. Alternatywnie można przygotować 50-krotny roztwór Denhardta z następujących odczynników:
  
  Albumina surowicy bydlęcej (A7906) 1%
  Ficoll (F2637) 1%
  Poliwinylopirolidon (PVP40) 1%
  
  Rozpuścić składniki w wodzie do końcowej objętości 50 ml. Sterylizować przez filtrację.
• *2X Roztwór do wstępnej hybrydyzacji (P1415), używany do przygotowania membrany do hybrydyzacji sondy. Alternatywnie można przygotować 1X roztwór do prehybrydyzacji (100 ml) z następujących odczynników:
  
  20X SSPE 30 mL
  100X roztwór Denhardta 10 mL
  10% SDS 10 mL
  Woda 50 mL
  
  
• *Roztwór do hybrydyzacji (H7140), używany podczas etapu hybrydyzacji. Alternatywnie można przygotować roztwór do hybrydyzacji (100 ml) z następujących odczynników:
  
  20X SSPE 30 ml
  10% SDS 10 ml
  Woda 60 ml
  
  
• 1X Bufor sondy, używany do mieszania sondy. (100 µL; przygotować świeży):
  
  1 M TRIS, pH 7.6 50 µL
  2 M MgCl₂ 5 µL
  0.5 M DTT 10 µL
  Woda 35 µL
  
  
• 1X Probe mix (27 µL):
  
  Bufor sondy 2,7 µL
  Sonda oligonukleotydowa (0.2 µg/µL) 2 µL
  Kinaza fosfonukleotydowa T4 (PNK) 1 µL
  Woda 11.3 µL
  ³²P-ATP 10 µL
  
• 6X Roztwór płuczący o niskiej restrykcyjności, używany do usuwania hybrydyzacji o niskiej homologii i redukcji szumów tła. Przygotować 600 ml roztworu płuczącego, używając następujących odczynników:
  
  20X SSPE 180 ml
  10% SDS 12 ml
  Woda 408 ml
  
  
• 1X Roztwór płuczący o wysokim stężeniu, używany do usuwania ściśle homologicznych hybrydyzacji i dalszego zmniejszania szumu tła. Przygotować 600 ml roztworu płuczącego przy użyciu następujących odczynników:
  
  20X SSPE 30 mL
  10% SDS 12 mL
  Woda 558 mL

*PerfectHyb™ Plus Hybridization Buffer (H7033) może być stosowany zamiast roztworów Denhardt, prehybrydyzacji i hybrydyzacji. Bufor PerfectHyb™ został zoptymalizowany w celu uzyskania maksymalnego sygnału przy minimalnym tle w hybrydyzacjach trwających zaledwie 1-2 godziny. PerfectHyb™ Plus został opracowany do pracy w dowolnym protokole hybrydyzacji, z wykorzystaniem dowolnego typu sondy i na dowolnym typie membrany (dodatnio naładowany lub neutralny nylon i nitroceluloza). 

Izolacja DNA

Sigma-Aldrich oferuje zestawy GenElute™ do izolacji DNA z roślin i grzybów (E5038), komórek lub tkanek ssaków (G1N70, G1N10 i G1N350.) i krwi (NA2010 i NA2020). Szczegółowy protokół izolacji DNA przy użyciu zestawów GenElute™ można znaleźć tutaj.

Dodatkowo, zestawy DNAstable^® (93000-001-1EA, 93021-001-1EA, 53091-016-2ML and 93121-017-1EA) mogą być używane w przypadku wysyłki DNA lub do przechowywania i stabilizacji DNA w temperaturze pokojowej.

Trawienie restrykcyjne

Traw próbkę DNA odpowiednim enzymem restrykcyjnym przez 2-24 h w temperaturze 37 °C. Jeśli próbka DNA pochodzi z klonu, wystarczający jest czas trawienia 1-2 h. W przypadku genomowego DNA zwykle wymagana jest całonocna inkubacja z nadmiarem enzymu (5-10X).

W razie potrzeby skoncentruj strawione DNA za pomocą wytrącania etanolu. Ślady etanolu muszą być całkowicie usunięte przed rozdzieleniem na żelu.

Elektroforeza żelowa

Rozpuścić strawione DNA na żelu agarozowym. TAE powinien być używany do krótszych przebiegów (4 godziny) i większych fragmentów DNA, podczas gdy TBE powinien być używany do dłuższych przebiegów (4 godziny) i mniejszych fragmentów DNA (1kb). Alternatywnie można użyć Bionic™ Buffer  (B6185), aby uzyskać ostrzejszą rozdzielczość pasm w krótszym czasie niż TAE lub TBE (więcej informacji można znaleźć Bionic™ Buffer Data). Zabarwić żel bromkiem etydyny i uzyskać obraz żelu za pomocą transiluminatora UV. Jeśli bromek etydyny został włączony do agarozy przed elektroforezą, obraz żelu można uzyskać natychmiast po przebiegu.

Transfer

Podczas etapu transferu DNA (lub RNA) z żelu elektroforetycznego zostanie przeniesione na nylonową membranę, dzięki czemu może być dostępne dla sondy do hybrydyzacji i wykrywania.

• Transferuj żel do tacy zawierającej roztwór denaturujący wystarczający do całkowitego pokrycia żelu. Przemyć żel dwukrotnie tym roztworem, każde płukanie trwające 25 minut na wytrząsarce.
  
• Płukać żel dwukrotnie wodą.
  
• Płukać żel dwukrotnie roztworem neutralizującym, każde płukanie trwające 15 minut na wytrząsarce.
  
• Płukać żel dwukrotnie wodą.
  
• Płukać żel 20X SSPE na wytrząsarce przez 30 min.
  
• Podczas powyższego kroku, przygotować papier Whatman i membranę do procedury transferu.
  
• Odetnij pasek membrany nylonowej (15356) i namocz go w wodzie. Wytnij pasek papieru Whatman, szerszy niż żel i namocz go w 10-krotnym buforze SSPE (bufor transferowy).
  
• Wytnij trzy paski papieru Whatman prawie tej samej wielkości co żel.
  
• Wytnij kilka ręczników papierowych prawie tej samej wielkości co żel.
  
• Umieść stabilną platformę na tacy zawierającej 10X SSPE.
  
• Umieść folię saran na platformie. Umieść papier Whatman nasączony 10X SSPE na folii saran. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione, zwijając je za pomocą szklanego pręta. Upewnij się, że krawędzie papieru Whatman dotykają buforu SSPE na tacy. Ten kawałek papieru Whatman będzie działał jak knot, który przeciągnie bufor SSPE w górę i przez żel, osadzając pasma DNA na nylonowej membranie.
  
• Umieść żel, twarzą w dół na mokrym papierze Whatman. Umieść membranę na górze żelu. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione, zwijając je za pomocą szklanego pręcika.
  
• Ułóż trzy paski papieru Whatman na membranie. Upewnij się, że pęcherzyki powietrza nie są uwięzione, zwijając je za pomocą szklanego pręta.
  
• Ułóż na tym stos ręczników papierowych, a następnie obciążnik (np. szklaną płytę).
  
• Pozostaw ten zestaw na noc w celu całkowitego przeniesienia fragmentów DNA. Transfer fragmentów DNA do 15kb zajmuje około 18 godzin.
  
• Po zakończeniu transferu umieść blot w urządzeniu sieciującym UV na automatycznym ustawieniu. Sieciowanie UV ma na celu kowalencyjne związanie DNA lub RNA z nylonową membraną, co zwiększa sygnały hybrydyzacji podczas wykrywania. Inną opcją jest wypalenie suchej membrany po transferze, co powoduje niekowalencyjne, ale półtrwałe wiązanie kwasów nukleinowych z membraną. DNA nie może być sieciowane UV do membrany nitrocelulozowej i musi być wypalane.

Rysunek 2. Montaż transferu Southern/northern blot

Prehybrydyzacja (blokowanie)

Etap prehybrydyzacji (znany również jako blokowanie) jest wykonywany w celu zminimalizowania niespecyficznego przyłączania sondy do membrany nylonowej. DNA spermy łososia jest powszechnie stosowane jako środek blokujący, aby zapobiec przywieraniu sondy do membrany, zapewniając, że będzie ona oddziaływać tylko z pożądanymi pasmami DNA, które zostały przeniesione na membranę. Przygotuj roztwór do wstępnej hybrydyzacji w następujący sposób lub użyj buforu PerfectHyb™ Plus (H7033):

• Ogrzej roztwór do wstępnej hybrydyzacji do 42 °C.
  
• Podgrzać próbkę DNA spermy łososia (D9156) do 95 °C przez 5 minut i natychmiast schłodzić na lodzie.
  
• Dodaj DNA spermy łososia do ciepłego roztworu do wstępnej hybrydyzacji, tak aby końcowe stężenie DNA wynosiło 50 µg/ml.
  
• Wyjmij blot z urządzenia sieciującego UV i ostrożnie zwiń go do probówki hybrydyzacyjnej.
  
• Dodaj roztwór prehybrydyzacyjny z DNA spermy do probówki hybrydyzacyjnej i umieść ją w temperaturze 42 °C w piecu hybrydyzacyjnym na 5 godzin.

Hybrydyzacja

Komplementarna nić DNA (sonda) jest używana do wykrywania pożądanej sekwencji, która powinna być obecna na membranie. DNA z dwóch różnych źródeł łączy się, tworząc "hybrydowy" dsDNA, ale tylko wtedy, gdy dwie nici są homologiczne.

• Przygotuj 1X mieszaninę sondy i inkubuj w łaźni wodnej w 37 °C przez 40 min.
  
• Wolną etykietę (niewłączoną sondę) można usunąć przepuszczając mieszaninę sond przez kolumnę G-25 Sephadex.
  
• Określić specyficzną aktywność sondy za pomocą ciekłej scyntylacji.
  
• Ogrzać 10 ml roztworu hybrydyzacyjnego do 49°C, dodać 10-15 X 10⁶ cpm sondy i dobrze wymieszać.
  
• Odrzuć roztwór do wstępnej hybrydyzacji z blotu; dodaj roztwór do hybrydyzacji ze znakowaną sondą. Inkubować przez noc w temperaturze 49°C.
  Uwaga: Alternatywnie można użyć buforu PerfectHyb™ Plus (H7033) do hybrydyzacji przez znacznie krótszy czas z większą wydajnością sygnału. Więcej informacji na temat protokołu i danych można znaleźć w PerfectHyb™ Plus Protocol.
  
• Ogrzej 6-krotny roztwór płuczący do 49 °C. Wyrzucić roztwór hybrydyzacyjny z blotu i dodać 6-krotny roztwór płuczący.
  
• Ogrzać 6-krotny roztwór płuczący o niskim stężeniu do 49oC. Wyrzucić roztwór hybrydyzacyjny z blotu i dodać 6-krotny roztwór płuczący. Płukanie o niskiej restrykcyjności usuwa hybrydyzacje o niskiej homologii w celu pozostawienia interakcji o wysokiej homologii, udoskonalając pożądaną próbkę DNA.
  
• Przygotuj 1X roztwór do płukania o wysokiej restrykcyjności i podgrzej go do 49oC. Płucz blot przez około 30 sekund i wyrzuć roztwór płuczący. Na tym etapie stosuje się roztwór o wysokim stężeniu w celu dalszego udoskonalenia pożądanego DNA poprzez usunięcie ściśle homologicznych hybrydyzacji.
  
• Sprawdź blot pod kątem aktywności za pomocą licznika Geigera. Pożądane są odczyty 10-50 zliczeń na sekundę z pasmami pików napromieniowania. Jeśli tło jest zbyt wysokie, należy ponownie przemyć blot 1-krotnym roztworem płuczącym.

Wykrywanie sondy

• Umieść blot w kasecie foliowej wyłożonej nową folią saran i ostrożnie zawiń blot, upewniając się, że między blotem a folią nie ma pęcherzyków powietrza.
  
• Przenieś kasetę do ciemni i umieść film rentgenowski na plamie. Zamknij kasetę i umieść ją w temperaturze -80°C na noc. Wywołaj film następnego dnia.
  
• Kolejny arkusz filmu rentgenowskiego może być umieszczony nad blotem i ponownie umieszczony w temperaturze -80 °C w celu kolejnej ekspozycji.

Protokół Northern Blotting

Protokół Northern Blotting jest podobny do protokołu Southern Blotting. Jednak sekwencje RNA są rozdzielane na denaturującym żelu agarozowym z dodatkiem formaldehydu.

Izolacja RNA

• Izolacja RNA z komórek lub próbek tkanek przy użyciu TRI Reagent^®  (T9424) lub zestawu GenElute™ dla komórek lub tkanek ssaków (RTN70, RTN10 i RTN350).
  
• Aby określić jakość i stężenie RNA, należy odczytać absorbancję próbek przy 260 nm i 280 nm. Stosunek absorbancji A₂₆₀/A₂₈₀ wynoszący 1,8-2,1 wskazuje na dobrą jakość RNA.

Elektroforeza żelowa

• Załaduj ostrożnie próbki do studzienek za pomocą pipet. W razie potrzeby można również załadować odpowiedni marker zawierający fragmenty RNA o różnych rozmiarach (R7020, R7644).
  
• Szczegółowy protokół denaturacji RNA w elektroforezie w żelu agarozowym znajduje się w Wprowadzenie do elektroforezy kwasów nukleinowych
  

Jeśli bromek etydyny został włączony do agarozy przed elektroforezą, obraz żelu można uzyskać natychmiast po przebiegu.

Transfer

Konfiguracja transferu, wstępna hybrydyzacja, hybrydyzacja i protokoły wykrywania są takie same jak w przypadku Southern blotting.

Odniesienie

1. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold spring harbor laboratory press.