Przygotowanie próbki i rozwiązywanie problemów z elektroforezą żelową

Prądy elektryczne, przewody, wyprowadzenia, grzebienie, przecieki... tak wiele okazji do kłopotów. Ale nadal używamy żeli, ponieważ elektroforeza pozostaje skutecznym sposobem oddzielania białek - dzięki czemu wyniki immunodetekcji opartej na przeciwciałach mogą być dość jednoznaczne.

Kliknij tematy Przygotowanie próbek i elektroforeza żelowa, aby przeczytać o możliwych przyczynach i środkach zaradczych:

• No Bands or Gel Front
  
• Próbka nie opada na dno studni
  
• Sample Leaking Out
  
• Bands Are Smeared Vertically
  
• Za dużo pasm
  
• /PL/plŻel działający niezwykle wolno
  
• /PL/plŻel działający niezwykle szybko
• 
  
• Paski białka zbyt blisko siebie (nie do końca rozwiązane)
  
• Lewe i/lub prawe pasma żelu są zniekształcone.
  
• Paski tworzą uśmiechnięte kształty

Brak opasek lub żelu z przodu

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Białka spłynęły z żelu	Zmniejsz czas działania żelu. Zmniejsz napięcie. Upewnij się, że przewody są ustawione w prawidłowej orientacji, ponieważ przewody elektroforezy do zasilacza mogą być odwrócone, powodując ucieczkę żelu w górę. Zwiększ procentową zawartość akrylamidu w żelu.
Niewystarczająca ilość białka została załadowana na żel	Załaduj więcej białka do każdej studzienki. Upewnij się, że stężenie białka w każdej próbce jest dokładne.
Próbka rozproszyła się od studzienki przed zastosowaniem zasilania./td>	Zmniejsz czas pomiędzy załadowaniem pierwszego dołka żelu i rozpoczęciem elektroforezy. Jeśli to konieczne, uruchom mniej żeli i/lub mniej pasów jednocześnie.
Za mało SDS w próbce	Bez odpowiedniej ilości SDS, białka nie są naładowane ujemnie i nie będą przemieszczać się przez komórkę. Zapewnij odpowiednie stężenie SDS.

Próbka nie opada na dno studni

Możliwa przyczyna	Receptura
Zwiększ stężenie glicerolu.

Próbka wyciekająca ze studni

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Studzienki uszkodzone podczas usuwania grzebienia	Usuń grzebień żelowy ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia studzienek. Delikatnie przepłucz studzienki buforem do elektroforezy przed załadowaniem próbki, aby wykryć uszkodzone studzienki.
Studzienki uszkodzone podczas ładowania próbki	Załaduj próbkę ostrożnie, upewniając się, że końcówka pipety nie dotyka dna lub boków studzienek.

Paski są rozmazane pionowo

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Niepełna rozpuszczalność białka blokuje białka przed wejściem do żelu	Zapewnienie odpowiedniej sonikacji/homogenizacji i wirowania podczas przygotowywania lizatu komórkowego w celu usunięcia cząstek stałych.
Degradacja białek	Dodaj/zwiększ stężenie inhibitorów proteazy/fosfatazy podczas przygotowywania lizatu komórkowego. Unikaj powtarzanych cykli zamrażania/rozmrażania lizatu komórkowego i próbek Western blot.
Zbyt duża ilość załadowanego białka Effect of loading too dużej ilości białka na SDS-PAGE (prawy skrajny pas)	Zmniejsz ilość białka załadowanego na studzienkę. Zapewnij dokładne stężenie białka w próbce.
Żel działa zbyt szybko	Zwiększ czas działania żelu.
Słaba jakość lub stary żel	Użyj świeżego żelu.

Zbyt wiele zespołów

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Degradacja białek	Dodaj/zwiększ stężenie inhibitorów proteazy/fosfatazy podczas przygotowywania lizatu komórkowego. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania lizatu komórkowego i próbek Western blot.
Agregacja białek	Zapewnij odpowiednie stężenie DTT, które redukuje wiązania dwusiarczkowe. Podgrzej próbki Western blot w łaźni wodnej przed załadowaniem na żel.

Żel działa niezwykle wolno

Możliwe przyczyny		Środek zaradczy
Bufory zbyt skoncentrowane	Rozcieńczyć bufory.
Zbyt niskie natężenie prądu	Zwiększyć napięcie aparatu do żelu.

Niezwykle szybkie działanie żelu

Możliwe przyczyny	Środek zaradczy
Bufory zbyt rozcieńczone	Skoncentruj bufory.
Zbyt wysokie natężenie prądu	Zmniejsz napięcie aparatu do żelowania.

Pasma białek zbyt blisko siebie (nie do końca rozwiązane)

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Niewystarczający czas działania	Uruchom żel na dłuższy okres czasu.
Nieprawidłowy rozmiar porów żelu	Użyj żelu gradientowego (wyższy procent akrylamidu na dole niż na górze), który odpowiednio rozdzieli szerszy zakres wielkości białek.

Skrajne lewe i/lub prawe pasma żelu są zniekształcone

Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Efekty brzegowe	Nie pozostawiać pustych dołków. Załaduj nieużywane studzienki niewielką ilością białka, aby zapobiec efektom krawędzi na sąsiednich pasach.

Zespoły tworzą uśmiechnięte kształty

Możliwa przyczyna	Receptura
Nadmierne ciepło Przebieg żelu jest "uśmiechnięty." Jest to spowodowane zbyt wysokim napięciem. Ponadto, docelowe pasma są wybielone, spowodowane użyciem odczynnika wykrywającego w zbyt wysokim stężeniu.	Przeprowadź żel przy niższym napięciu przez dłuższy czas. Użyj schłodzonych buforów i przeprowadź żel w chłodnym pomieszczeniu lub zapakowany w lód.