Rozwiązywanie problemów z wynikami 2-D DIGE

 

Ta tabela rozwiązywania problemów zawiera listę problemów, które mogą wystąpić w wynikach dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej (2D DIGE). Tabela zawiera opisy możliwych przyczyn słabych wyników i oferuje metody zapobiegania problemom w przyszłych eksperymentach.

 

Objaw	Możliwa przyczyna	Środek zaradczy
Nie są widoczne wyraźne plamki	Próbka jest niewystarczająca. Niewystarczająca ilość próbki dostała się do żelu Immobiline® DryStrip z powodu słabej solubilizacji próbki.	Zwiększ ilość nałożonej próbki. Zwiększ stężenie składników solubilizujących w roztworze próbki (patrz sekcja 1.6).
	Próbka zawiera zanieczyszczenia, które uniemożliwiają ogniskowanie.	Zwiększ czas ogniskowania lub zmodyfikuj metodę przygotowania próbki.
	Gradient pH jest nieprawidłowo ustawiony.	Końcówka "+" paska Immobiline® DryStrip jest końcówką kwasową i powinna być skierowana w stronę anody (+).
	(Format żelu płaskiego) Żel Immobiline® DryStrip jest umieszczony niewłaściwą stroną do dołu na żelu drugiego wymiaru.	Upewnij się, że żel Immobiline® DryStrip jest umieszczony stroną z żelem do dołu (plastikowym spodem do góry) na żelu SDS drugiego wymiaru.
	Metoda wykrywania nie była wystarczająco czuła.	Użyj innej metody wykrywania (np. barwienie srebrem zamiast barwienia błękitem Coomassie).
	Awaria odczynników do wykrywania. Przygotuj świeże roztwory barwiące.	Sprawdź daty ważności na roztworach barwiących.
Pojedyncze białka pojawiają się jako wiele plam lub ich brakuje, są niejasne lub w niewłaściwej pozycji	Karbamylacja białek.	Nie podgrzewaj żadnych roztworów zawierających mocznik powyżej 30 °C, ponieważ cyjanian, produkt degradacji mocznika, spowoduje karbamylację białek, zmieniając ich pI.
	Oksydacja białek.	Użyj roztworu DeStreak Rehydration Solution. Podczas wyrównywania dodaj DTT w pierwszym etapie, aby zredukować disiarczek. Dodaj jodoacetamid w drugim etapie, aby alkilować grupy tiolowe, aby zapobiec ponownemu utlenianiu białek.
Zniekształcenie wzoru 2-D	(Pionowy format żelu) Górna powierzchnia żelu drugiego wymiaru nie jest płaska.	Natychmiast po wylaniu żelu, pokryj powierzchnię nasyconym wodą 1-butanolem.
	(Pionowy format żelu) Nierówna polimeryzacja żelu spowodowana niekompletną polimeryzacją, zbyt szybką polimeryzacją lub wyciekiem podczas odlewania żelu.	Odgazowanie roztworu żelu. Polimeryzację można przyspieszyć zwiększając o 50% ilość użytego nadsiarczanu amonu i TEMED. Polimeryzację można spowolnić, zmniejszając o 33% ilość nadsiarczanu amonu i TEMED. Upewnij się, że nie ma wycieków podczas odlewania żelu.
Poziome smugi lub niekompletnie skupione plamki (anodowa aplikacja próbki, w której problem jest widoczny na anodowym końcu paska IPG)	Próbka naniesiona przy zbyt kwaśnym pH.	Zwiększyć stężenie buforu IPG w próbce i pasku Immobiline® DryStrip. Dodaj nieco więcej alkalicznego buforu IPG do próbki. Nałóż próbkę na katodę. Uwaga: Powtarzane cykle roztwarzania strąceniowego powodują lub zwiększają poziome smugi. Patrz rozdział 1.6 (Skład roztworu do przygotowania próbki), aby uzyskać ogólne wytyczne dotyczące roztwarzania próbki.
Poziome smugi lub niekompletnie skupione plamki (ładowanie rehydracyjne)	Próbka jest słabo rozpuszczalna w roztworze rehydracyjnym.	Zwiększ stężenie składników solubilizujących w roztworze rehydracyjnym (patrz sekcja 2.6, Składniki roztworu nawadniającego). Zwiększenie stężenia buforu IPG.
	Niedostateczne ogniskowanie. Czas ogniskowania nie był wystarczająco długi, aby osiągnąć ogniskowanie w stanie ustalonym.	Długi czas ogniskowania.
Poziome smugi lub niekompletnie zogniskowane plamy (wszystkie przykładowe metody aplikacji)	Substancje zakłócające. Zanieczyszczenia niebiałkowe w próbce mogą zakłócać IEF, powodując poziome smugi.	Zmodyfikuj przygotowanie próbki, aby ograniczyć te zanieczyszczenia. Użyj zestawu 2-D Clean-Up Kit (sekcja 1.4.1, Cleaning up samples using 2-D Clean-Up Kit). Wpływ zanieczyszczeń jonowych można zmniejszyć, modyfikując protokół IEF. Należy ograniczyć napięcie do 100-150 V przez 2 godziny, a następnie wznowić normalny program kroków napięcia. Pozwoli to jonom w próbce przemieścić się na końce żelu Immobiline® DryStrip.
	Detergent jonowy w próbce.	Jeśli do przygotowania próbki używany jest detergent jonowy SDS, jego końcowe stężenie nie może przekraczać 0,25% po rozcieńczeniu w roztworze rehydratacyjnym. Dodatkowo, stężenie niejonowego detergentu musi być co najmniej osiem razy wyższe niż stężenie jakiegokolwiek detergentu jonowego, aby zapewnić całkowite usunięcie SDS z białka.
Poziome paski w poprzek żelu	Zanieczyszczenia w agarozie lub roztworze wyrównującym.	Przygotować świeżą nakładkę agarozową i roztwór wyrównawczy
Wyraźna pionowa smuga w miejscu nałożenia próbki (podczas ładowania Immobiline< sup>® Drysup>® DryStrip i kubków na próbki)	(Format żelu płaskiego) Agregacja próbki lub wytrącanie.	Rozcieńczyć próbkę i nałożyć większą objętość. Zaprogramować niskie napięcie początkowe i stopniowo zwiększać napięcie.
Pionowa szczelina we wzorze 2-D	Zanieczyszczenia w próbce.	Zmień sposób przygotowania próbki.
	Zanieczyszczenia w składnikach roztworu nawadniającego.	Używaj tylko odczynników wysokiej jakości. Dejonizować roztwory mocznika.
	Pęcherzyk powietrza pomiędzy żelem Immobiline® DryStrip a górną powierzchnią żelu drugiego wymiaru.	Upewnij się, że między żelem Immobiline® DryStrip a górną powierzchnią żelu drugiego wymiaru nie ma pęcherzyków powietrza.
	(Format żelu płaskiego) Kryształy mocznika na powierzchni żelu Immobiline® DryStrip.	Pozwolić, aby resztki roztworu wyrównawczego spłynęły z żelu Immobiline® DryStrip przed umieszczeniem paska na żelu drugiego wymiaru.
	(Format żelu płaskiego) Pęcherzyki powietrza pod żelem Immobiline® DryStrip.	Upewnij się, że żel Immobiline® DryStrip jest mocno umieszczony na żelu, bez pęcherzyków powietrza uwięzionych pod spodem. Delikatnie pociągnij plastikowy spód żelu Immobiline® DryStrip kleszczami, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
Słaba reprezentacja białek o wyższej masie cząsteczkowej	Proteoliza próbki.	Przygotuj próbkę w sposób ograniczający proteolizę i/lub użyj inhibitorów proteaz (Inhibicja proteazy przy użyciu mieszaniny inhibitorów proteazy).
	Niewystarczająca równowaga.	Długi czas wyrównania.
	Niedostateczny transfer białka z żelu Immobiline® DryStrip do żelu drugiego wymiaru.	Zastosowanie fazy wprowadzania próbki o niskim natężeniu prądu w przebiegu elektroforezy drugiego wymiaru.
	Niedostateczne wprowadzanie białka próbki podczas nawadniania.	Użyj zalecanej objętości roztworu rehydratacyjnego (Tabela 18, Using DeStreak Rehydration Solution).
Punktowe zacieranie	(Barwienie srebrem) Brudne płytki używane do wyrzucania żelu lub cząstek stałych na powierzchnię żelu. DTT i inne środki redukujące tiol nasilają ten efekt.	Prawidłowo umyj szklane płytki. Usunąć nadmiar lub pozostałości środka redukującego tiol za pomocą jodoacetamidu przed załadowaniem żelu Immobiline® DryStrip na żel drugiego wymiaru.
Rozmaz tła w kierunku dołu żelu	(Barwienie srebrem lub błękitem Coomassie) Barwienie amfolitów nośnikowych.	Użyć buforu IPG jako mieszaniny amfolitów nośnikowych. W razie potrzeby zmniejszyć stężenie. Wydłużyć czas utrwalania.
Rozmaz tła w kierunku górnej części żelu	(Barwienie srebrem) Kwasy nukleinowe w próbce.	Dodaj DNazę i RNazę w celu hydrolizy kwasów nukleinowych. Uwaga: Białka DNaza i RNaza mogą pojawić się na mapie 2-D.
Wysokie tło w górnym obszarze żelu	Zanieczyszczenie białkowe w buforze do elektroforezy SDS lub brudna jednostka do elektroforezy.	Wykonać świeży bufor SDS do elektroforezy. Wyczyścić jednostkę do elektroforezy.