Wprowadzenie do SDS-PAGE - separacja białek na podstawie ich wielkości

Żele poliakryloamidowe powstają w wyniku reakcji akryloamidu i bis-akryloamidu (N,N'-metylenobisakryloamidu), w wyniku której powstaje silnie usieciowana matryca żelowa. Żel działa jak sito, przez które białka przemieszczają się w odpowiedzi na pole elektryczne. Białka zawierają ogólny ładunek dodatni lub ujemny; umożliwia to ruch cząsteczki białka w kierunku punktu izoelektrycznego, w którym cząsteczka nie ma ładunku netto. Poprzez denaturację białek i nadanie im jednolitego ładunku ujemnego, możliwe jest ich oddzielenie w oparciu o rozmiar, gdy migrują w kierunku elektrody dodatniej.

Rysunek 1. SDS-PAGE próbek białek i kolorowy marker białkowy(C1992)

Protokół

Wymagane materiały i odczynniki

• Pionowa komora do elektroforezy z zasilaczem, szklane płytki, przekładki i grzebienie

Wymagane odczynniki	Składniki w odczynniku	Numer produktu
Roztwór akrylamidu/bis-akrylamidu	Akrylamid  29.2 g Bis-akrylamid 0.8 g	01696 M7279
Bufory do odlewania żeli	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (do przygotowania żelu rozdzielającego): Rozpuścić 18.15 g zasady Tris w 80 ml wody destylowanej. Dostosować pH do 8,8 za pomocą 6N HCl. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą destylowaną. 0,5 M Tris-HCl, pH 6.8 (do przygotowania żelu do układania): Rozpuścić 6 g zasady Tris w 80 ml wody destylowanej. Dostosować pH do 6,8 za pomocą 6N HCl. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml wodą destylowaną.	93362
2X Laemmli loading  buffer	Błękit bromofenolowy 0.004% 2-merkaptoetanol 10% Glicerol 20% SDS 4% Tris-HCl 0.125 M	B5525 M3148 G5516 L3771 93362
10X Running buffer	Tris-HCl 25 mM Glicyna 200 mM SDS 0.1% (w/v)	93362 G8898 L3771
10% SDS	SDS	L3771
10% Nadsiarczan amonu	.Nadsiarczan amonu	A3678
.TEMED	TEMED	T9281

UWAGA: Akrylamid i bis-akrylamid są z natury neurotoksyczne. Wszystkie czynności należy wykonywać w bezpudrowych rękawiczkach.

Przygotowanie żelu

• Oczyść szklane płytki i przekładki urządzenia do odlewania żelu dejonizowaną wodą i etanolem.
• Złóż płytki z przekładkami na stabilnej, równej powierzchni.
• Przygotuj roztwór żelu rozdzielającego używając następujących objętości (dla 10 ml) w zależności od wymaganego procentu żelu.

Żel %	Woda (mL)	30% akrylamid (mL)	1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
8%	4.6	2.6	2.6	100	100	10
10%	3.8	3.4	2.6	100	100	10
12%	3.2	4.0	2.6	100	100	10
15%	2.2	5.0	2.6	100	100	10
*TEMED musi być ostatnim dodanym składnikiem

• Wlej roztwór żelu do płytek zmontowanych z przekładkami. Aby utrzymać równą i poziomą powierzchnię żelu rozdzielczego, pokryj powierzchnię wodą lub izopropanolem (I9516).
  
• Pozwolić żelowi stwardnieć przez około 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
  
• Przygotować roztwór żelu stackingowego używając następujących objętości (dla 10 ml):
  

Żel %	Woda (mL)	30% akrylamid (mL)	0.5 M Tris-HCl, pH 6.8 (mL)	10% SDS (µL)	10% APS (µL)	TEMED*(µL)
5%	5.86	1.34	2.6	100	100	10

*TEMED musi być ostatnim dodanym składnikiem

• Usuń nadmiar wody lub izopropanolu na żelu rozdzielającym
• Dodaj 5% roztwór żelu do układania, aż się przeleje. Natychmiast włóż grzebień, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w żelu lub w pobliżu studzienek.
• Pozwól żelowi zastygnąć przez około 20-30 minut w temperaturze pokojowej.
  

Przygotowanie próbki

• Do objętości próbki białka (lizatu komórek lub tkanek) dodać taką samą objętość buforu obciążającego.
  
• Powyższą mieszaninę gotować w temperaturze 95°C przez 5 minut. Wirować z prędkością 16000 xg przez 5 minut.
  
• Próbki te mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub mogą być użyte do elektroforezy żelowej.

Barwienie żeli

Barwienie błękitem Coomassie: Barwienie żeli białkowych błękitem brylantowym Coomassie R-250 jest powszechną procedurą wizualizacji białek rozdzielonych przez SDS-PAGE. Jest bardzo czułe i nadaje się do długotrwałego przechowywania żeli.

Wymagane odczynniki

• Roztwór utrwalający żel (500 ml)
  
      Metanol (M3641) 250 mL
        
   M3641.kwas octowy lodowaty (695092) 50 mL
       Woda 200 mL
  
  
• Roztwór kumassu
  
       CBB R-250 (B6529) 0.1%
      Metanol (M3641) 40%
        %
   M3641).nbsp;kwas octowy lodowaty (695092) 10%
       Przefiltrować roztwór barwnika przy użyciu bibuły filtracyjnej Whatmann No. 1.
  
  
• Roztwór barwiący
  
       inbsp;Metanol (M3641) 50 ml
       kwas octowy lodowaty (#695092) 35 mL
  
  
• Roztwór do przechowywania żelu
  
       kwas octowy lodowaty (695092) 25 ml
       Woda 475 ml

Procedura

• Po elektroforezie umieść żel na plastikowej tacy zawierającej roztwór utrwalający żel. Umieść tackę na stole kołyskowym i utrwal białka na 2 godziny.
  
• Usuń roztwór utrwalający żel i dodaj roztwór Coomassie.  Umieść na stole kołyskowym i zabarw żel na 2-4 godziny.
  
• Po etapie barwienia, przepłucz żel kilka razy wodą destylowaną, aby usunąć nadmiar barwnika.
  
• Dodaj roztwór destain do żelu. Umieść na stole kołyskowym i destainuj przez około 4 godziny, aż widoczne będą wyraźne niebieskie pasma na przezroczystym tle.
  
• Po destainowaniu żele mogą być przechowywane w roztworze do przechowywania żeli i fotografowane w razie potrzeby.

Barwienie srebrem

Oferujemy wysoce czuły zestaw do wykrywania białek za pomocą barwienia srebrem, odpowiedni do żeli SDS-PAGE. Dodatkowo potrzebne są następujące odczynniki:

• Roztwór utrwalający
  
      . Etanol (E7023) 50 mL
       Kwas octowy 10 mL
       Woda 40 mL
  
  
• 30% etanol .(E7023)

Procedura

• Po przebiegu elektroforetycznym zanurzyć żel w roztworze utrwalającym na 40 min. Całonocne zanurzenie w utrwalaczu zapewni wyraźniejsze tło.
  
• Usuń roztwór utrwalający i przemywaj żel przez 10 minut 30% roztworem etanolu, a następnie przemywaj ultraczystą wodą przez 10 minut.
  
• Zlać wodę i inkubować żel w roztworze sensybilizatora przez 10 min.
  
• Usuń roztwór sensybilizatora i przemyj żel dwukrotnie wodą, każde przemywanie trwające 10 min.
  
• Zlać wodę i zanurzyć żel na 10 minut w roztworze srebra.
  
• Zlać roztwór srebra i umyć żel w wodzie przez 1,5 minuty.
  
• Usuń wodę i zanurz żel w roztworze wywoływacza na 3 do 7 min.
  
• Dodaj 5 ml roztworu zatrzymującego do roztworu wywoływacza i inkubuj przez 5 min. Usuń wywoływacz/roztwór zatrzymujący i płucz żel w ultraczystej wodzie przez 15 minut.
  
• Żel może być fotografowany, a także przechowywany w świeżej, ultraczystej wodzie.

Dla podwójnego barwienia, zabarw żel przy użyciu CBB R-250, a następnie srebra przy użyciu powyższych procedur.

Barwniki fluorescencyjne: Oferujemy fluorescencyjne barwniki SYPRO i Lucy do elektroforezy białek. Żele mogą być zanurzone w barwniku fluorescencyjnym w ciemności lub żel może być mieszany z buforem katodowym podczas elektroforezy.

Protokoły barwienia zależą od używanego barwnika i można je znaleźć tutaj:

• SYPRO^® Ruby Protein Gel Stain (PDF)
  
• LUCY^® 506 Solution (PDF)
  

Odwracalne barwienie żelem

.Odwracalne barwienie żelu pozwala użytkownikowi przejść do western blotting białek po SDS-PAGE.

Barwienie R-PROB: R-PROB to unikalny barwnik, który wykrywa białka na żelach PAGE i western blot.

Wymagane odczynniki:

• Reversible Protein Detection Kit for Membranes and Polyacrylamide Gels (RPROB)
  
• Roztwór utrwalający (F7264)
  
• 10% kwas octowy
  
• EDTA 50 mM

Procedura

• Zanurzyć żele po elektroforezie w roztworze utrwalającym na 20 minut. Powtórzyć ten krok dwukrotnie.
  
• Płukać żel w wodzie dwukrotnie, każde płukanie trwające 30 minut.
  
• Inkubować żel w roztworze barwiącym przez 20-40 minut z delikatnym mieszaniem.
  
• Zmyć nadmiar barwnika w 10% kwasie octowym.
  
• W celu odbarwienia, przemyć żel EDTA, a następnie dwa płukania po 15 minut w wodzie lub roztworze utrwalającym.

Barwienie miedzią: Aby potwierdzić migrację i separację białek, żel można zabarwić odwracalnym barwnikiem, takim jak CuCl₂.

Wymagane odczynniki

• 0,3 M CuCl₂ roztwór
  
• 0.25 M roztwór Tris i 0,25 M roztwór EDTA

Procedura

• Płukać żele po elektroforezie w wodzie destylowanej przez maksymalnie 30 min.
  
• Zanurzyć żel w 0,3 M roztworze CuCl₂ na 10 min.
  
• Płukać wodą dejonizowaną.
  
• Białka mogą być wizualizowane jako przezroczyste strefy na niebieskim tle.
  
• W celu całkowitego odbarwienia żelu do western blot, przemyć zabarwione żele w 0,25 M Tris.25 M roztworze Tris i 0,25 M roztworze EDTA, pH 9, wielokrotnie.
  
• Przenieś wybarwiony żel do buforu transferowego przed przystąpieniem do konfiguracji transferu.

Rysunek 2. System do blottingu i elektroforezy pionowej

Jeśli pożądane jest przeniesienie białek na membranę po elektroforezie, prosimy o zapoznanie się z protokołem tutaj.

Odniesienie

1. Sambrook J, Fritsch T, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.