Odtwarzalność przy użyciu buforów biologicznych
Czym są bufory biologiczne?
Bufory biologiczne to substancje organiczne, które utrzymują stałe pH w danym zakresie poprzez neutralizację działania jonów wodorowych. Bufory są powszechnie stosowane w badaniach biochemicznych, biologicznych i środowiskowych w celu utrzymania lub kontrolowania kwasowości roztworu w pożądanym zakresie fizjologicznym, a nawet zainicjowania określonej reakcji. Odczyn pH substancji wpływa nie tylko na szybkość i wydajność reakcji chemicznych, ale także na odzysk i czystość produktów. W badaniach biologicznych pH ma wpływ na strukturę i funkcję białek, reakcje enzymatyczne i metabolizm komórkowy. Dlatego też bufory w znacznym stopniu przyczyniają się do wyników takich badań. Najczęściej stosowanymi buforami w badaniach biologicznych są zwitterionowe pochodne N-podstawionych aminokwasów, zwane również buforami biologicznymi lub buforami Gooda.1,2
Kryteria dla buforów biologicznych
Chociaż żaden z buforów biologicznych nie spełnia wszystkich poniższych wymagań, oczekuje się, że spełnią one większość z nich:
- pKa między 6,0 a 8.0, zakres, w którym zachodzi większość reakcji biologicznych
- Wysoka rozpuszczalność w wodzie i niska rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, których stosunek określa dystrybucję buforu między środowiskiem wodnym a fazą biologiczną
- Niska rozpuszczalność lipidów z nieprzepuszczalnością błon biologicznych
- Minimalny wpływ na dysocjację buforu od wszelkich zmian temperatury, siły jonowej i stężenia
- Preferencyjnie nie tworzy kompleksów z metalami śladowymi, metalami alkalicznymi lub innymi jonami
- Wysoka stabilność z odpornością na degradację enzymatyczną; nie działa jako inhibitor enzymu lub analog substratu
- Nie absorbuje światła w zakresie widzialnym lub UV, które są głównie wykorzystywane w testach spektrofotometrycznych
- Minimalne interakcje z solą i krytycznymi składnikami reakcji<
- Efektywny kosztowo i łatwy w przygotowaniu
Niski wskaźnik odtwarzalności badań przedklinicznych
Powtarzalność odnosi się do zdolności do uzyskiwania takich samych wyników w eksperymentach badawczych przy użyciu dokładnie tych samych materiałów i procedur. Odtwarzanie oryginalnych wyników opublikowanych odkryć ma kluczowe znaczenie dla społeczności zajmującej się badaniami biomedycznymi w celu wyciągnięcia wniosków i zbadania nowych obszarów badań, które mogą przełożyć się na zastosowania terapeutyczne. Ostatecznie, taka strata czasu i możliwości negatywnie wpływa na odkrywanie ratujących życie terapii i leków.
Jednak powtarzalne badania od dawna stanowią poważne wyzwanie dla społeczności naukowej, ponieważ wielu badaczy opiera się na istniejących podstawowych informacjach badawczych w celu prowadzenia dalszych badań, które mogą nie być wiarygodne i mogą prowadzić do błędnych założeń oraz znacznych strat czasu i pieniędzy. Leonard P. Freedman, prezes Global Biological Standards Institute, i współautorzy opublikowali w 2015 roku artykuł "The Economics of Reproducibility in Preclinical Research", w którym szacuje się, że każdego roku na przedkliniczne badania medyczne, których nie można odtworzyć, wydaje się szokującą kwotę 28 miliardów dolarów.
Niedokładność w zakresie odtwarzalności badań i dalsze badania oparte na błędnych przesłankach nie tylko marnują zasoby i fundusze, ale mogą również wpływać na reputację i perspektywy kariery naukowców i instytutów badawczych, a także mogą mieć negatywny wpływ na reputację i poczytność czasopism.
Kilka ostatnich publikacji zwróciło uwagę na kwestię niskiego wskaźnika odtwarzalności w badaniach przedklinicznych. W 2012 roku naukowcy z firmy Amgen poinformowali, że byli w stanie odtworzyć jedynie 6 z 53 "przełomowych" badań przedklinicznych, co doprowadziło do wzmożonej dyskusji wśród społeczności naukowej na temat skali problemu odtwarzalności i rozwoju inicjatyw mających na celu przezwyciężenie tego problemu.
Ogólnie rzecz biorąc, brak odtwarzalności może być spowodowany projektem badania, niedokładnością protokołu laboratoryjnego, słabą analizą danych i raportowaniem oraz nieodpowiednimi odczynnikami biologicznymi i stosowanymi materiałami referencyjnymi.3 Poniższy rysunek ilustruje kluczowe źródła braku odtwarzalności i skalę tego kryzysu.
Źródła braku odtwarzalności - koszt jest wysoki
Rysunek 1. Szacowane wydatki na badania przedkliniczne w USA i kategorie błędów, które przyczyniają się do braku odtwarzalności. [Należy zauważyć, że wartość procentowa błędu dla każdej kategorii jest punktem środkowym szacunków wysokiej i niskiej częstości występowania dla tej kategorii podzielonym (ważonym) przez sumę wszystkich środkowych poziomów błędu].
W 2014 r. przeprowadzono ankietę "Second Annual State of Translational Research", w której uczestnicy odpowiadali na pytania dotyczące grup produktów powodujących największe trudności z odtwarzalnością badań. Wyniki tej ankiety wykazały, że największe obawy budziły modele zwierzęce, przeciwciała, linie komórkowe, odczynniki i startery PCR, odczynniki do hodowli komórkowych, znaczniki fluorescencyjne, barwniki, bufory i rozpuszczalniki.
Bufory są szeroko stosowane w szeregu protokołów i zastosowań w badaniach podstawowych, przemyśle farmaceutycznym i biofarmaceutycznym. Zmienność w doborze i jakości tych buforów może mieć znaczący wpływ na powtarzalność badań. Dlatego istnieje duża potrzeba lepszego zrozumienia i szkolenia w zakresie ich wyboru i stosowania.
Przewodnik wyboru buforów biologicznych
Większość procesów biologicznych zależy od pH, a każda niewielka zmiana pH może prowadzić do zmian funkcji biologicznej, stabilności biomolekuł i wyniku eksperymentu. Głównym celem buforu w systemie biologicznym jest odporność na zmiany pH spowodowane wpływami wewnętrznymi i zewnętrznymi oraz utrzymanie wewnątrzkomórkowego i zewnątrzkomórkowego pH w wąskim zakresie.
Potencjalne przeszkody związane z buforami można podzielić na dwie kategorie:
a. Zmienność między partiami buforów
- Zawartość wody: Zmienność między partiami może zmienić stężenie roztworu, jeśli bufory są ważone i nie są korygowane pod kątem zawartości wody.
- Morfologia: Składniki buforów są produktami krystalicznymi o różnej wielkości cząstek, kształcie cząstek, charakterystyce mielenia i gęstości upakowania. Może to mieć wpływ na skanowanie w podczerwieni (IR). Na przykład HEPES jest polimorficzny i może występować w 2-3 różnych morfologiach; w związku z tym jego skanowanie w podczerwieni może się różnić. Dlatego ważne jest, aby wybrać odpowiedni bufor, jeśli skan IR jest używany jako kryterium charakterystyki.
- Pierwiastki śladowe: Obecność pierwiastków śladowych może mieć wpływ na systemy biologiczne i hodowlę komórkową. Na przykład obecność Cu, Zn i Se ma kluczowe znaczenie dla wydajności hodowli komórek ssaków podczas produkcji przeciwciał i może wpływać na wydajność przeciwciał terapeutycznych.
- Zanieczyszczenia z syntezy: Produkty uboczne i artefakty, takie jak kwas poliwinylosulfonowy (PVS) i wolne aminy, które powstają podczas syntezy wielu buforów organicznych, mogą wpływać na wydajność procesów biologicznych, w tym aktywność enzymów, agregację białek i właściwości bioaktywne.
Wysoka czystość buforów ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia minimalnych poziomów pierwiastków śladowych, zanieczyszczeń chemicznych i zanieczyszczeń biologicznych, które zapewniają spójność między partiami dla lepszej odtwarzalności.
b. Interakcje z systemami biologicznymi
Chociaż zakłada się, że bufory biologiczne mają minimalną interakcję z jonami metali obecnymi w środowisku i systemach biologicznych, kilka badań wykazało ostatnio, że jest inaczej. Dlatego istotne jest zrozumienie, w jaki sposób bufory te oddziałują z jonami metali i innymi materiałami biologicznymi, takimi jak białka.
Na przykład każdy enzym, który wymaga jonów metali do swojej aktywności, może zostać zahamowany, jeśli stosowany bufor tworzy nierozpuszczalny kompleks z tymi jonami metali. Kompleksy powinny być zatem rozpuszczalne, a ich stała wiązania znana. Fosforany tworzą nierozpuszczalne sole z metalami dwuwartościowymi i wytrącają się. Dlatego roztwór soli buforowanej fosforanami (PBS) nigdy nie jest autoklawowany z Ca2+ lub Mg2+. Bufory biologiczne, takie jak PIPES, TES, HEPES i CAPS, mają bardzo niskie stałe wiązania metali i są szczególnie odpowiednie do badania enzymów zależnych od metali. Jednakże, Bis-Tris Propan, ADA i Tris silnie oddziałują z różnymi jonami metali.
Poniżej znajduje się przegląd siły kompleksowania różnych par metal-bufor2 :
Rysunek 2. Pary metal-bufor - kompleksowanie
- Zielony = Brak kompleksowania, nadaje się do ogólnego użytku
- Żółty = Lekka kompleksacja
- Magenta = Silna kompleksacja, nie nadaje się do ogólnego użytku
- Cyan = Dane niezgodne (konieczne dalsze badania lub ostrożność)
Rysunek 3. Interakcja z metalami - przydatność bufora
- Cyan = Odpowiedni do ogólnego użytku
- czerwony = nie nadaje się do ogólnego użytku
Ten uproszczony wykres przedstawia zakresy pH dla różnych buforów biologicznych. Kolory cyjan i czerwony wskazują, czy bufor nadaje się do ogólnego użytku. Bufory w kolorze czerwonym powinny być używane ostrożnie, gdy metale są stosowane lub obecne w systemie biologicznym.
Takie interakcje metali mogą mieć wpływ na:
- wzrost i przeżywalność komórek
- interakcje z błonami komórkowymi i makrocząsteczkami
- pomiar DNA, RNA i białek
- badania redoks
- Rozdzielanie chromatograficzne
- Stabilizacja/destabilizacja białek
W związku z tym kluczowe jest uwzględnienie tych właściwości przy wyborze odpowiedniego buforu do konkretnego eksperymentu.
Poprawa odtwarzalności dzięki buforom biologicznym
Posiadamy szeroką gamę buforów biologicznych. Interaktywny przewodnik wyboru buforów pomaga w znalezieniu odpowiedniego buforu w zależności od pH, klasy, rodzaju opakowania lub zastosowania.
Jesteśmy głównym producentem wysokiej jakości buforów biologicznych i posiadamy dogłębną wiedzę naukową, możliwości analityczne i wsparcie techniczne dla tych podstawowych produktów. Dzięki ponad 25-letniemu doświadczeniu w produkcji jesteśmy silnym, stabilnym dostawcą z wieloma dedykowanymi zakładami produkującymi bufory do realizacji zamówień badawczych i hurtowych (ilości od kilku gramów do wielu ton metrycznych). Co więcej, posiadamy certyfikat ISO 9001:2008 i kontrolowane systemy zgodne z GMP lub poziomem M-Clarity, aby zapewnić spójność między partiami i przejrzystość łańcucha dostaw.
Praktyczne wskazówki dotyczące poprawy odtwarzalności za pomocą buforów
Wiedząc, że istnieją potencjalne obawy związane ze stosowaniem buforów biologicznych, ważne jest, aby zwrócić naszą uwagę na niektóre z praktycznych wskazówek, które można pogrupować w 3 główne obszary.
Rysunek 4. Poprawa odtwarzalności za pomocą buforów
1. Wskazówki dotyczące wyboru buforae):
- Pierwszym punktem odniesienia dla badaczy przy wyborze buforu powinna być wcześniejsza literatura, protokół i/lub standardowe procedury operacyjne w celu optymalizacji warunków, takich jak pH, temperatura itp.
- Dobrym pomysłem jest również rozważenie celu buforu i wszelkich dalszych zastosowań. Na przykład niektóre środki buforujące, takie jak ACES i ADA, mogą absorbować światło o różnych długościach fali, co może wpływać na dalsze pomiary.
- Wybór optymalnej substancji buforującej w celu zapewnienia, że pKa buforu jest zbliżone do pożądanego pH, aby zmaksymalizować pojemność buforową, ma kluczowe znaczenie. Inne obawy można również rozwiązać, wybierając bufory wolne od jakiejkolwiek aktywności enzymatycznej, zwłaszcza produkt wolny od DNAzy/RNAzy lub proteazy. Ponadto, jeśli chodzi o metale, należy wybrać substancję buforową, która ma niski poziom zanieczyszczeń metalami i nie chelatuje metali.
- Badacze często muszą stosować dodatki, takie jak sole, detergenty itp. w celu poprawy stabilności białek lub zapobiegania utlenianiu-redukcji lub innej agregacji. Ważne jest, aby rozpoznać możliwe interakcje buforów z tego typu dodatkami.
- Wreszcie, wybór dostawcy i ostatecznej substancji buforowej z szerokiej gamy opcji dostępnych na rynku, w tym szeroki wybór klas i jakości buforów, ma zasadnicze znaczenie. Na przykład, do zastosowań niekrytycznych można wybrać bufory o niskiej jakości do użytku ogólnego, a do produkcji farmaceutycznej można starannie wybrać produkty o bardziej rygorystycznych wymaganiach. Ponadto należy wziąć pod uwagę wiele różnych formatów, takich jak proszki, płyny, koncentraty lub produkty gotowe do użycia.
Poniższa tabela ilustruje różne klasy buforów, w zależności od rodzaju dalszego zastosowania.
2. Wskazówki dotyczące przygotowania, przechowywania i stosowania buforów:
Są to ogólne zalecenia i zależą od zastosowania, branży, środowiska regulacyjnego i innych czynników.
- Bufory występują w różnych dostępnych na rynku formatach, takich jak proszek, produkty gotowe do użycia, płynne koncentraty itp. Do rozpuszczania lub rozcieńczania tych produktów należy stosować wysokiej jakości wodę (wolną od jonów metali, materii organicznej, cząstek stałych i innych zanieczyszczeń), stosując systemy oczyszczania wody, zwłaszcza w zastosowaniach krytycznych. Innymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę podczas przygotowywania buforu, są przewodność/wh używanej wody oraz warunki pracy, takie jak temperatura i siła jonowa, ponieważ wpływają one na pKa. Ponieważ nie wszystkie bufory można sterylizować w autoklawie, można zastosować filtrację submikronową, aby zapobiec zanieczyszczeniu i wzrostowi.
- Dostępnych jest wiele odniesień do przechowywania buforów, takich jak przewodnik po dobrej praktyce laboratoryjnej (GLP) i elektroniczny kodeks przepisów federalnych w USA. Dobrą praktyką jest odpowiednie oznaczanie buforów (wskazując tożsamość, miano lub stężenie, wymagania dotyczące przechowywania i daty ważności), aby zapewnić, że nie zostaną one zamienione lub omyłkowo użyte w warunkach laboratoryjnych lub przechowywania. Należy unikać buforów, które utraciły ważność lub stały się mętne lub odbarwione, ponieważ najprawdopodobniej są zanieczyszczone. W przypadku roztworów buforowych dostarczanych przez dostawców należy przestrzegać warunków przechowywania zalecanych przez producentów.
- Zwykle bufory powinny być przygotowywane bezpośrednio przed użyciem. Jeśli nie jest to możliwe, należy postępować zgodnie z wcześniej zalecanymi wytycznymi dotyczącymi przechowywania. Zawsze dobrze jest przefiltrować roztwory robocze przed użyciem, aby upewnić się, że są one wolne od wszelkich zanieczyszczeń lub cząstek stałych.
3. Wskazówki dotyczące publikacji
- W wielu publikacjach brakuje ważnych informacji na temat kluczowych użytych odczynników, w tym buforów. Wiele artykułów zawiera informacje o dostawcy i marce buforów, ale może nie podawać różnych informacji, takich jak gatunek lub czystość. Zalecenia dotyczące dokumentowania i raportowania buforów obejmują markę buforu, numer produktu, klasę lub jakość oraz numer partii lub serii. Ponadto skład buforu, stężenie robocze i warunki reakcji, takie jak pH koncentratu i roztworu roboczego, temperatura, w której mierzono pH, a także producent i model pH-metru przyczyniają się do zwiększenia powtarzalności badań. Wielu wydawców zdaje sobie obecnie sprawę ze znaczenia dostarczania takich informacji i udostępnia repozytoria danych uzupełniających.
Zbadaliśmy i opracowaliśmy przydatny przewodnik referencyjny, który jest interaktywna tabela buforów z informacjami o użytecznych zakresach pH dla każdego buforu, stężeniach roboczych buforu, niekorzystnych interakcjach jonów metali, zmianach pKa w zależności od temperatury, różnych produktach lub klasach oferowanych dla tej substancji, a także zamierzonych zastosowaniach.
Naszym celem jest rozwiązywanie najtrudniejszych problemów w naukach przyrodniczych poprzez współpracę z globalną społecznością naukową. Mamy nadzieję, że zajmując się kwestiami odtwarzalności badań i rozpowszechniając wiedzę na ten temat, pomożemy naukowcom przezwyciężyć przeszkody w badaniach naukowych.
Nasze bufory z certyfikatem BioPerformance oferują wygodę, jakość i odtwarzalność.
Nasze bufory z certyfikatem BioPerformance oferują wygodę, jakość i odtwarzalność.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?