Urządzenie do elektroforezy żelowej Auto2D^®

Jak działa dwuwymiarowa elektroforeza żelowa? Techniki jednowymiarowej elektroforezy żelowej białek, takie jak SDS-PAGE, są rutynowo wykonywane w laboratorium, metody te oferują niską zdolność rozdzielania. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2-DE) rozdziela białka w złożonych próbkach według wartości pI i masy cząsteczkowej, umożliwiając bezpośrednie porównanie setek lub tysięcy białek jednocześnie z wysoką rozdzielczością. W połączeniu z oprogramowaniem analitycznym, immunodetekcją lub technikami spektrometrii mas, 2-DE stanowi potężne narzędzie, które pomaga w identyfikacji białek i innych analizach proteomicznych. Aby uzyskać dodatkowe zasoby i produkty, odwiedź naszą stronę Elektroforeza białek i Western Blotting.

• W pełni zautomatyzowana elektroforeza 2-D w żelu
• Jak przeprowadzić elektroforezę 2-D w żelu za pomocą urządzenia Auto2D^® 2-D Electrophoresis Device?
• Dlaczego używamy elektroforezy 2-D żelowej?
• Auto2D^® Elektroforeza żelowa 2-D do zastosowań w alergiach pokarmowych
• Auto2D^® System do walidacji przeciwciał anty-HCP w testach ELISA i innych testach immunologicznych
• Auto2D^® System do profilowania antygenów

W pełni zautomatyzowana dwuwymiarowa elektroforeza żelowa

Dwuwuwymiarowa elektroforeza żelowa jest ogólnie uważana za trudną do wykonania i czasochłonną, wymagającą zaawansowanego szkolenia użytkownika, a jednocześnie oferującą niską powtarzalność i dużą zmienność międzyoperacyjną. System Auto2D^® w pełni automatyzuje dwuwymiarową elektroforezę żelową. Zastosowana próbka wchodzi pasywnie do żelu pierwszego wymiaru, rozdzielając białka według ich punktów izoelektrycznych. Po wyrównaniu, żel pierwszego wymiaru jest umieszczany na poziomym żelu SDS-PAGE, który rozdziela białka według masy cząsteczkowej. Urządzenie do elektroforezy dwuwymiarowej Auto2D^® jest przyjazne dla użytkownika i umożliwia przeprowadzenie elektroforezy dwuwymiarowej w ciągu 1-2 godzin, zapewniając szybsze i bardziej powtarzalne wyniki. Dodatkowe funkcje i zalety urządzenia Auto2D^® 2-D Electrophoresis Device obejmują:

• Łatwy w użyciu, bez konieczności zaawansowanego szkolenia
• Szybkie wdrożenie przepływu pracy w celu skrócenia przestojów w laboratorium
• Zmniejszona zmienność międzyoperacyjna i wyższa powtarzalność
• Obsługa IQ/OQ w celu zapewnienia zgodności z GMP

JAK URUCHOMIĆ 2-D ŻEL ZA POMOCĄ Auto2D^® 2-D ELECTROPHORESIS DEVICE?

.

Urządzenie Auto2D^® 2-D Electrophoresis Device w pełni automatyzuje dwuwymiarową elektroforezę żelową, upraszczając analizę białek i zapewniając bardziej spójne, powtarzalne wyniki, które są niezależne od użytkownika. Efektywna inżynieria systemu Auto2D^® znacznie skraca czas poświęcony na załadunek próbki, ogniskowanie izoelektryczne, równowagę i SDS-PAGE z 4-24 godzin do zaledwie 1-2 godzin. To sprawia, że urządzenie Auto2D^® jest wyjątkowe w porównaniu z innymi półautomatycznymi systemami 2-DE dostępnymi na rynku.

Rysunek 1. Przebieg pracy dwuwymiarowej elektroforezy żelowej i etapy zautomatyzowane przez urządzenie Auto2D®.

Dlaczego stosujemy elektroforezę żelową 2-D?

Urządzenie do elektroforezy 2-D Auto2D^® zostało sprawdzone w wielu zastosowaniach. Przykłady odpowiednich zastosowań obejmują analizę różnicowej ekspresji białek w badaniach nad rakiem i wyjaśnianie mechanizmów chorobowych. Dodatkowe zastosowania obejmują wykorzystanie do oddzielania oczyszczonych białek do krystalizacji lub analizy modyfikacji potranslacyjnych oraz 2-D western blotting w obszarach badawczych, takich jak badania alergii lub analiza szlaków sygnalizacji komórkowej.

Rysunek 2. Po lewej: Analiza różnicowej ekspresji białek w hodowanych komórkach do badań biomarkerów nowotworowych. Kolor zielony reprezentuje białka występujące w większej ilości w normalnych komórkach. Czerwony reprezentuje białka specyficzne dla raka. Żółty reprezentuje nakładanie się ekspresji białek. Po prawej: Różnicowa ekspresja białek w próbkach osocza.

Rysunek 3. Po lewej: Ocena mikroheterogeniczności produktów leczniczych zawierających przeciwciała. Czerwony trójkąt wskazuje miejsca dla docelowego przeciwciała; dolne miejsca to brakujące regiony przeciwciała. Po prawej: Analiza białek przed i po oczyszczeniu. 2-DE można wykorzystać do sprawdzenia, czy próbka jest jednorodna do krystalizacji i rentgenowskiej analizy strukturalnej.

Rysunek 4. Białka ekstraktu mąki (wykryte przez SYPRO Ruby) przez SDS-PAGE (A), WB: przeciwciało antygliadynowe przez SDS-PAGE (B) i połączenie przez SDS-PAGE (C). Białka ekstraktu mąki (wykryte przez SYPRO Ruby), strzałki wskazują plamy wykryte przez przeciwciało antygliadynowe (D). WB z użyciem przeciwciała antygliadynowego (E) i połączenie (F).

Auto 2D^® Elektroforeza żelowa 2-D do zastosowań w alergiach pokarmowych

Zważywszy na dużą i rosnącą liczbę osób cierpiących na alergie na całym świecie, coraz ważniejsze staje się wykrywanie i identyfikacja alergenów, zwłaszcza w żywności. Dwuwymiarowa elektroforeza żelowa (2D-E) jest tradycyjnie stosowana do separacji białek o wysokiej rozdzielczości, niezbędnej do immunodetekcji białek alergennych. Jednak ten tradycyjny proces separacji jest często czasochłonny i trudny technicznie. Nasz system Auto2D^® umożliwia w pełni zautomatyzowaną elektroforezę 2-D w ciągu 1-2 godzin z szybkimi i wiarygodnymi wynikami. Tutaj pokazujemy, że nasz system Auto2D^® jest odpowiedni do identyfikacji białek alergennych z wielu różnych źródeł.

Alergie są powszechnym problemem zdrowotnym na całym świecie, z trzema głównymi źródłami alergenów, w tym żywnością (szacuje się, że dotyka 4% światowej populacji), lekami farmaceutycznymi (szacuje się, że 10% populacji) i pyłkami roślin (szacuje się, że 10-30% populacji i rośnie) ^1-3. Reakcje alergiczne występują poprzez odpowiedź immunologiczną, w której pośredniczy IgE i tradycyjnie były badane za pomocą testu skórnego; jednak testy alergenowe i diagnostykę można również osiągnąć za pomocą podejść molekularnych ¹. Test radioalergosorpcyjny (RAST) i test immunoenzymatyczny (ELISA) to dwie metody stosowane do wykrywania i ilościowego oznaczania IgE przeciwko określonym alergenom. Ponieważ testy RAST i ELISA nie obejmują etapu separacji białek, reaktywność krzyżowa między przeciwciałami i składnikami matrycy żywności może w niektórych przypadkach powodować fałszywie dodatnie wyniki ¹. 

Elektroforeza żelowa jest powszechną i szeroko stosowaną metodą separacji białek. Podczas gdy standardowa jednowymiarowa elektroforeza żelowa rozdziela białka na podstawie ich masy cząsteczkowej, dwuwymiarowa elektroforeza żelowa zapewnia wyższą rozdzielczość poprzez rozdzielanie białek na podstawie punktu izoelektrycznego (pI). Ta zwiększona rozdzielczość pozwala badaczom na rozróżnienie białek o zbliżonej masie cząsteczkowej, szczególnie w przypadku izoform, które mogą mieć różną alergenność. Technika elektroforezy żelowej 2D ma również niską zmienność techniczną, co czyni ją dobrą opcją do badań, które mają wpływ na zdrowie ludzi, takich jak identyfikacja alergenów ⁴.

Elektroforeza żelowa 2D do immunodetekcji alergii pokarmowych

Technika elektroforezy żelowej 2D i późniejsza immunodetekcja zostały wykorzystane do identyfikacji wielu alergennych białek z różnych źródeł. Badacze pyłków roślin wykorzystali tę technikę do identyfikacji nowych białek wiążących IgE z pyłku czerwonego dębu, a także do potwierdzenia klinicznie istotnych alergenów w naturalnym ekstrakcie z trawy, w tym wielu izoform jednego alergennego białka ^5,6. Elektroforeza żelowa 2D została wykorzystana w dogłębnym badaniu głównych rodzin alergenów orzeszków ziemnych, porównując różne szczepy orzeszków ziemnych, a także została wykorzystana do potwierdzenia braku różnic w alergenach między naturalną i genetycznie zmodyfikowaną soją ^7,8.

Tutaj demonstrujemy użyteczność systemu elektroforezy żelowej Auto2D^® w wykrywaniu alergenów z czterech źródeł żywności: trzech roślin (soja, orzech włoski i gryka) i jednego źródła zwierzęcego (ikra łososia). Dodatkowo, nasz system został z powodzeniem wykorzystany do identyfikacji specyficznych alergenów po immunodetekcji przy użyciu surowicy pacjenta. Wykorzystaliśmy system Auto2D^® do rozdzielenia pojedynczych pasm z SDS-PAGE na wiele odrębnych plam białkowych odpowiadających głównym znanym alergenom w próbkach soi i ikry łososia. Wyniki te sugerują, że system elektroforezy żelowej Auto2D^® może być stosowany do identyfikacji alergenów, skracając zarówno czas, jak i niezbędną wiedzę techniczną, zapewniając jednocześnie wysokiej jakości, wiarygodne wyniki.

Auto2D^® 2-D do zastosowań w alergiach pokarmowych Wyniki

Ekstrakt z soi otrzymano przez namoczenie 2,5 g komercyjnie dostępnej soi.5 g dostępnych w handlu ziaren soi w 25 ml wody destylowanej przez noc, rozdrabniając je za pomocą młynka i wyciskając przez gazę. Stężenie białka było podobne do mleka sojowego (około 30 µg/μL). Następnie 30 μg próbki poddano analizie przy użyciu systemu Auto2D^®, a 0,5 μL konwencjonalnemu SDS-PAGE. W przypadku 2D-E z systemem Auto2D^®, IEF Chip pH3-10NL został wybrany jako 1. wymiar, a PAGE Chip 12,5% jako 2. wymiar. Próbkę poddano elektroforezie przy użyciu standardowego programu (pH3-10NL M). Po elektroforezie białka w żelach 1D SDS-PAGE i Auto2D^® wybarwiono barwnikiem Coomassie Brilliant Blue Stain (CBB). Oddzielna próbka została uruchomiona na naszym urządzeniu Auto2D® i została przeniesiona na membranę Immobilon^® P blotting za pomocą półsuchego blottingu. W celu immunodetekcji, membranę do blottingu zablokowano 5% NFDM w PBS-T. Po zablokowaniu, sojową surowicę pacjenta z alergią (International Bioscience, Inc.) rozcieńczono 20x w roztworze blokującym, dodano do membrany i inkubowano z delikatnym mieszaniem. Po przemyciu PBS-T, membranę poddano reakcji z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP rozcieńczonym w roztworze blokującym, a następnie standardowej detekcji chemiluminescencyjnej. 

Rysunek 5. Separacja 2D-E ekstraktu soi i immunodetekcja z użyciem surowicy pacjenta. Ekstrakt białka sojowego rozdzielono za pomocą SDS-PAGE (A: 15 ug) i systemu Auto2D^® (B, C: 30 ug) przy użyciu IEF Chip: pH3-10NL, PAGE Chip: 12,5% i zestawu odczynnika Tris-Glycine. Całe białko w żelu wybarwiono CBB (A-1, B). Immunodetekcję przeprowadzono przy użyciu surowicy pacjenta uczulonego na soję (A-2, C). Odpowiadające głównemu pasmu w SDS-PAGE, plamy uważane za Gly m 6, główny składnik alergenu soi, wykryto około 18 kDa (czerwone strzałki).

Każdą dodatkową próbkę antygenu przygotowywano odpowiednio w następujących warunkach. Mąkę gryczaną odtłuszczono eterem dietylowym, potraktowano buforem kokainowym (85 mM NaCl, 32,7 mM NaHCO₃, 42,5 mM fenolu) i dializowano PBS. Aby usunąć sole i zanieczyszczenia jonowe, które mogą wpływać na proces IEF 1-D, ekstrakt gryki poddano dalszej obróbce przy użyciu zestawu do wytrącania białek (zestawy ProteoExtract^®). Orzechy włoskie zostały zmiażdżone w moździerzu, a ekstrakcję białek przeprowadzono przy użyciu zestawu do lizy komórek ssaków (MCL1, Sigma). Tkankę ikry łososia homogenizowano w 1M KCl-PBS. Ekstrakty z orzecha włoskiego i ikry łososia odsolono za pomocą kolumn wirówkowych z filtracją żelową. W zależności od metody odsalania, próbki białek rozpuszczono lub wymieniono na roztwór rehydratacyjny (8M mocznik, 2M tiomocznik, 4% CHAPS, 50mM DTT, 0,02% amfolit).

Obliczanie ilości białka dla każdej przygotowanej próbki przeprowadzono przy użyciu testu BCA lub Bradford. Separację białek przeprowadzono przy użyciu wstępnie zainstalowanego standardowego programu Auto2D^® (receptura "pH3-10NL M") lub konwencjonalnej metody SDS-PAGE. IEF Chip pH3-10NL i PAGE Chip 12,5% zostały wybrane jako chipy żelowe 1-D i 2-D, aby pokryć jak najszerszy zakres separacji. Po elektroforezie rozdzielone białka w żelach Auto2D^® barwiono barwnikiem Coomassie ReadyBlue™ lub barwnikiem SYPRO^® Ruby Gel. Oddzielnie przygotowane żele Auto2D^® do immunodetekcji były usuwane z chipa i przenoszone na membranę Immobilon®-P przy użyciu urządzenia do transferu na mokro (KS8452, Oriental Instrument). Membrany PVDF z przeniesionymi białkami blokowano buforem blokującym SuperBlock™ w PBS przez 1 godzinę. Surowice pacjentów rozcieńczono 30-krotnie PBS zawierającym 0,1% BRIJ i pozostawiono do reakcji z membranami podczas wytrząsania w temperaturze 4°C przez noc. Po przepłukaniu błony powyższym buforem rozcieńczającym, jako drugorzędowe Ab zastosowano skoniugowane z fosfatazą alkaliczną (AP) przeciwciało anty-ludzkie IgE Ab (SeraCare) rozcieńczone 2000-krotnie i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 godziny. Po przemyciu membranę wyrównano w buforze reakcyjnym AP (100 mM bufor Tris-HCl pH 9,5 zawierający 100 mM NaCl i 5 mM MgCl₂) i poddano reakcji z 1-składnikowym typem substratu BCIP/NBT (SeraCare) w celu chromogenicznego wykrycia białek docelowych.

Rysunek 6. Rozdzielanie 2D-E ekstraktu białka orzecha włoskiego i immunodetekcja z alergiczną surowicą pacjenta. Ekstrakt białka orzecha włoskiego odsolono w kolumnie wirówkowej do filtracji żelowej, wyrównano roztworem nawadniającym i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE (A) i systemu Auto2D^® (B, C, D: 10 ug) przy użyciu IEF Chip: pH3-10NL, PAGE Chip: 12,5% i zestawu odczynnika Tris-Glycine. Całe białko w ekstrakcie z orzecha włoskiego jest wizualizowane przez czerń amidową na membranie (A) i przez barwnik żelowy SYPRO^® Ruby (B), immunodetekcję przy użyciu surowicy pacjenta (C) i surowicy niealergicznej jako kontroli negatywnej (D).

Rysunek 7. Immunodetekcja z użyciem surowicy pacjenta uczulonego na grykę. Ekstrakt białka gryki poddany działaniu zestawu do wytrącania ProteoExtract^® rozpuszczono w roztworze rehydratacyjnym i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE (A) i systemu Auto2D^® (B, C, D: 10 ug) przy użyciu IEF Chip: pH3-10NL, PAGE Chip: 12,5% i zestawu odczynnika Tris-Glycine. Całe białko w ekstrakcie z gryki jest wizualizowane przez Amido Black na membranie (A-1) lub odczynnik SYPRO^® Ruby w żelu (B). Immunodetekcja przy użyciu surowicy pacjenta (A-2 i C) i surowicy niealergicznej jako kontroli negatywnej (A-3 i D).

Rysunek 8. Separacja i immunodetekcja składników alergicznych poprzez sondowanie surowicą pacjenta z alergią na ikrę łososia. Ekstrakt białka ikry łososia odsolono w kolumnie wirówkowej do filtracji żelowej, wyrównano roztworem nawadniającym i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE (A) i systemu Auto2D^® (B, C, D) przy użyciu IEF Chip: pH3-10NL, PAGE Chip: 12,5% i zestawu odczynnika Tris-Glycine. Całe białko w ekstrakcie z ikry łososia jest wizualizowane przez Amido Black na membranie (A-1) lub odczynnik barwiący ReadyBlueTM CBB w żelu (B, 35 ug). Immunodetekcja przy użyciu surowicy pacjenta (A-2 i C, 10 ug) i surowicy niealergicznej jako kontroli negatywnej (A-3 i D: 10 ug). Plamki (czerwone strzałki) o masie około 15 do 20 kDa są uważane za główne alergeny β'-komponentu ikry łososia, który jest fragmentem witelogeniny o masie 35 kDa składającym się z dwóch podjednostek.

Obrazy Western blot porównano z całkowitą detekcją białka w celu zidentyfikowania plam białkowych, które reagowały z IgE w surowicach alergicznych. Aby zidentyfikować składnik alergenny, nakładające się plamy są zwykle wycinane z żelu, enzymatycznie trawione w żelu na fragmenty peptydowe, a fragmenty są analizowane za pomocą analizy widma masowego.   2D-E był w stanie wykazać lepszą rozdzielczość, pokazując obecność wielu białek w tym, co wydawało się być pojedynczym pasmem w 1D-E. Dane te sugerują, że białka reagujące z IgE można oddzielić i zidentyfikować w mniejszej liczbie etapów za pomocą immunodetekcji 2D przy użyciu surowic alergicznych, co łatwiej umożliwia identyfikację cząsteczek sprawczych za pomocą analizy widma masowego.

Auto2d^® 2-D do zastosowań w alergiach pokarmowych Omówienie

Dwuwuwymiarowa elektroforeza żelowa jest powszechną techniką separacji białek stosowaną do wykrywania i identyfikacji białek alergennych. System Auto2D^® został zaprojektowany w celu zmniejszenia czasu i wiedzy technicznej niezbędnej do uzyskania wysokiej jakości wyników tej techniki. Tutaj potwierdzamy przydatność systemu Auto2D^® do badań nad alergiami poprzez wykrywanie alergenów w próbkach białek z czterech źródeł żywności. Dodatkowo, byliśmy w stanie rozdzielić znany, główny alergen w każdej z próbek soi i ikry łososia z pojedynczego pasma w jednowymiarowej SDS-PAGE na wiele odrębnych plam przy użyciu systemu Auto2D^®. W próbce soi rozdzieliliśmy trzy plamy z pasma 18 kDa, które odpowiada podstawowej podjednostce Gly m 6 (glicyny), głównego, znanego białka alergennego 9. W próbce ikry łososia rozdzieliliśmy wiele plam z pasma 16-18 kDa, które odpowiada dwóm podjednostkom β'-składnika (witellogeniny), również głównego, znanego białka alergennego 10. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te sugerują, że system Auto2D^® może być skutecznie stosowany jako szybka, niezawodna alternatywa dla tradycyjnej elektroforezy żelowej 2D do immunodetekcji alergenów.

Podziękowania:

Z wdzięcznością dziękujemy prof. Tatsuya Moriyama (Kindai University, Faculty of Agriculture) za dostarczenie danych dotyczących soi i prof. Yasuto Kondo (Fujita Health University Bantane Hospital) za dostarczenie danych dotyczących orzechów włoskich, gryki i ikry łososia.

Pomiar pozostałości HCP w biofarmaceutykach

Elektroforeza żelowa 2-D jest również odpowiednia do analizy zanieczyszczeń białek komórek gospodarza (HCP) w bioprocesie białek terapeutycznych i przeciwciał. Resztkowe zanieczyszczenia HCP wprowadzane podczas procesów produkcji leków biologicznych mogą wywoływać reakcje immunogenne u pacjentów i zmniejszać skuteczność leku. Zgodność z przepisami wymaga monitorowania i usuwania HCP do akceptowalnie niskich poziomów w celu zapewnienia bezpieczeństwa. Farmakopee w Japonii, Europie i Stanach Zjednoczonych opublikowały wytyczne dotyczące opracowywania i walidacji testów HCP do wytwarzania produktów biofarmaceutycznych.

Aby spełnić wymagania zgodności, testy HCP muszą być metodycznie opracowywane z rygorystyczną kwalifikacją wszystkich składników testu. Do walidacji przeciwciał wymagana jest dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (2D-PAGE), aby zapewnić kompleksowe pokrycie HCP. Metody elektroforezy żelowej, w tym 2D-PAGE, są również zalecane do charakteryzowania antygenów stosowanych jako wzorce kalibracyjne lub immunogeny do produkcji przeciwciał poliklonalnych. Urządzenie do elektroforezy 2D Auto2D^® eliminuje potrzebę zaawansowanego szkolenia użytkowników, ułatwiając wdrożenie do procesów bioprocesowych w celu spełnienia zgodności ze standardami branżowymi.

Auto2D^®. Systemy do walidacji przeciwciał anty-HCP w testach ELISA i innych testach immunologicznych

Testy ELISA są najpowszechniejszym formatem testów do analizy HCP. Ta metoda immunologiczna opiera się na przeciwciałach poliklonalnych, które rozpoznają pozostałości HCP w szerokim zakresie. Farmakopea Japońska i Europejska określają stosowanie elektroforezy żelowej 2-D, a następnie analizy Western blot (2-D Western blotting) w celu oceny pokrycia przeciwciałami HCP. Farmakopea Amerykańska określa stosowanie 2-D Western blotting lub oczyszczania immunopowinowactwa, a następnie elektroforezy żelowej w celu oceny pokrycia przeciwciałami.

Rysunek 9. 20 μg antygenu CHO HCP znakowanego Cy3 z komercyjnego źródła rozdzielono za pomocą elektroforezy w żelu 2-D w systemie Auto2D^® przy użyciu układu IEF o pH 3-10 i 12,5% układu PAGE (A). Białka przeniesiono następnie na membrany i analizowano metodą Western blot z użyciem dwóch różnych przeciwciał anty-HCP (B, C). Dane wskazują, że przeciwciało anty-HCP 1 ma szersze pokrycie białek komórek gospodarza w porównaniu do przeciwciała anty-HCP 2.

Wysoka powtarzalność systemu Auto2D^®

Spójne, powtarzalne procesy są niezbędne w produkcji leków biologicznych i kontroli jakości. Oprócz szybszych wyników i większej przepustowości, w pełni zautomatyzowany system elektroforezy żelowej Auto2D^® eliminuje codzienną i międzyoperatorską zmienność w metodach 2D-PAGE i 2D-DIGE, oferując znacznie lepszą odtwarzalność i bardziej wiarygodne wyniki.

Rysunek 10. 0,75 μg antygenu CHO HCP znakowanego Cy5 z komercyjnego źródła rozdzielono za pomocą elektroforezy żelowej 2D i przeanalizowano w systemie Auto2D^® przy użyciu IEF Chip pH 3-10NL i PAGE Chip 12,5%. Ta sama próbka została zmierzona łącznie trzy razy (A-C). Białe punkty (D) pokazują nakładanie się wyników. Dane sugerują wysoką powtarzalność dwuwymiarowej elektroforezy żelowej przy użyciu systemu Auto2D^®.

Auto2D^® System do profilowania antygenów

Immunizacja antygenem HCP jest wymagana do uzyskania puli przeciwciał poliklonalnych do testu ELISA i innych testów immunologicznych. Antygen HCP jest również stosowany jako wzorzec kalibracyjny do wykrywania i oznaczania ilościowego. Specyficzne dla procesu antygeny HCP są generowane przy użyciu nietransfekowanych hodowli komórek zerowych. Antygeny te muszą zostać scharakteryzowane, aby pokazać wzór HCP, potwierdzić obecność szerokiego spektrum białek i wykazać, że antygeny HCP z hodowli zerowych są reprezentatywne dla tych w hodowlach produkcyjnych. Farmakopea Japońska, Europejska i Amerykańska zalecają stosowanie SDS-PAGE lub elektroforezy żelowej 2-D do charakterystyki i profilowania antygenów. Farmakopea Amerykańska sugeruje również stosowanie elektroforezy żelowej 2-D jako metody uzupełniającej do monitorowania pozostałości HCP.

Rysunek 11. Mieszanina znakowanego Cy3 nieoczyszczonego antygenu CHO HCP i znakowanego Cy5 oczyszczonego antygenu CHO HCP białka A została rozdzielona i przeanalizowana za pomocą dwuwymiarowej elektroforezy różnicowej (2D-DIGE) przy użyciu systemu Auto2D^® (A-B). Czerwone punkty w połączonych danych (C) reprezentują białka komórek gospodarza, które mają tendencję do pozostawania nawet po oczyszczeniu białka A. Dane te pokazują zastosowanie systemu Auto2D^® do profilowania pozostałych składników białkowych komórek gospodarza po oczyszczeniu.

System uto2D^® dla zgodności z przepisami<

System Auto2D^® pomaga spełnić wymogi regulacyjne dotyczące analizy HCP w produkcji biofarmaceutycznej. Ten w pełni zautomatyzowany system eliminuje zmienność dzienną i międzyoperacyjną, zapewniając wiarygodne wyniki w czasie krótszym niż 2 godziny. System Auto2D^®, łatwy do wdrożenia w procesach bioprocesowych, skraca czas przestoju laboratorium związany ze zmianami w produkcji. Nie ma potrzeby outsourcingu - chroń swoją własność intelektualną, korzystając z wewnętrznych zasobów do analizy HCP. Aby uzyskać dodatkowe produkty i zasoby, odwiedź naszą stronę Elektroforeza białek i Western Blotting.

Referencje

1. De Angelis M, Di Cagno R, Minervini F, Rizzello CG, Gobbetti M. 2010. Two‐dimensional electrophoresis and IgE‐mediated food allergy. Electrophoresis. 31(13):2126-2136. https://doi.org/10.1002/elps.201000101

2. WAO White Book on Allergy. [Internet]. WAO White Book on Allergy : Available from: https://www.worldallergy.org/wao-white-book-on-allergy

3. Schmidt CW. 2016. Pollen Overload: Seasonal Allergies in a Changing Climate. Environ Health Perspect. 124(4): https://doi.org/10.1289/ehp.124-a70

4. Pallen C, Friry-Santini C, Herouet-Guicheney C, Capt A. 2014. Technical variability of 2D gel electrophoresis – Application to soybean allergens. Toxicology Reports. 1734-742. https://doi.org/10.1016/j.toxrep.2014.09.002

5. Huerta-Ocampo JÁ, Valenzuela-Corral A, Robles-Burgueño MDR, Guzmán-Partida AM, Hernández-Oñate MÁ, Vázquez-Moreno L, Pavón-Romero GF, Terán LM. 2020. Proteomic identification of allergenic proteins in red oak (Quercus rubra) pollen. World Allergy Organization Journal. 13(3):100111. https://doi.org/10.1016/j.waojou.2020.100111

6. Corti V, Cattaneo A, Bachi A, Rossi RE, Monasterolo G, Paolucci C, Burastero SE, Alessio M. 2005. Identification of grass pollen allergens by two‐dimensional gel electrophoresis and serological screening. Proteomics. 5(3):729-736. https://doi.org/10.1002/pmic.200401038

7. Mamone G, Di Stasio L, De Caro S, Picariello G, Nicolai MA, Ferranti P. 2019. Comprehensive analysis of the peanut allergome combining 2-DE gel-based and gel-free proteomics. Food Research International. 1161059-1065. https://doi.org/10.1016/j.foodres.2018.09.045

8. Batista R, Martins I, Jenö P, Ricardo CP, Oliveira MM. 2007. A Proteomic Study to Identify Soya Allergens – The Human Response to Transgenic versus Non-Transgenic Soya Samples. Int Arch Allergy Immunol. 144(1):29-38. https://doi.org/10.1159/000102611

9. Hou DH, Chang SK. 2004. Structural Characteristics of Purified Glycinin from Soybeans Stored under Various Conditions. J. Agric. Food Chem.. 52(12):3792-3800. https://doi.org/10.1021/jf035072z

10. Shimizu Y, Kishimura H, Kanno G, Nakamura A, Adachi R, Akiyama H, Watanabe K, Hara A, Ebisawa M, Saeki H. 2014. Molecular and immunological characterization of β′-component (Onc k 5), a major IgE-binding protein in chum salmon roe. 26(3):139-147. https://doi.org/10.1093/intimm/dxt051