Protokół wyboru genów referencyjnych qPCR

PCR Technologies Protocols Table of Contents

Optymalizacja warunków qPCR

Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatury annealingu.

Analiza danych ekspresji genów wymaga stabilnego odniesienia lub kontroli obciążenia. Odniesieniem jest zwykle jeden lub więcej genów referencyjnych. Odpowiednie geny referencyjne to te, na które nie mają wpływu różnice w próbkach i zabiegach eksperymentalnych, i należy je określić dla każdego modelu eksperymentalnego. Podczas przeprowadzania próby wyboru stabilnych genów referencyjnych kluczowe znaczenie ma to, aby wybrane geny pochodziły z różnych szlaków biologicznych, a ich ekspresja była regulowana niezależnie. Idealnie byłoby, gdyby wszyscy kandydaci na geny referencyjne byli testowani na pięciu próbkach testowych i pięciu próbkach kontrolnych. 

Sprzęt

• Urządzenie do ilościowej reakcji PCR
• Okap z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)

Odczynniki

• cDNA rozcieńczone 1:100 (bardziej rozcieńczone cDNA jest zwykle wystarczające do wykrycia genów referencyjnych o wysokiej ekspresji, dla genów o średniej ekspresji należy użyć rozcieńczenia 1:10).
• KiCqStart^® SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - w zależności od urządzenia, Tabela P4-6).
• Woda klasy PCR: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) jako 20 ml podwielokrotności; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności dla każdej reakcji.
• Startery do przodu i do tyłu dla testowanych genów referencyjnych (zapas 10 μM).Uwaga: odpowiednia lista genów znajduje się w Tabeli P15-37. Są one dostępne jako KiCqStart^® Primery, które są wstępnie zaprojektowanymi testami, jak pokazano (sekwencje primerów są dostarczane wraz z produktem). 

Tabela P17-42 SYBR^® Green PCR Mix Selection Guide.

Hot Start ReadyMixes (Taq, Buffer, dNTPs, Reference Dye, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, Cat. Nr kat. KCQS00	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , Cat. Nr kat. KCQS01	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ z ROX, Cat. Nr kat. KCQS02	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ, Cat. Nr kat. KCQS03
Kompatybilne urządzenia:	Kompatybilne instrumenty:	Kompatybilne instrumenty:	Kompatybilne instrumenty:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Fast Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

Dostawy

• Filtr sterylny końcówki do pipet
• Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)
• Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z formatów:
  -    Pojedyncze cienkościenne probówki PCR o pojemności 200 μL (Z374873 lub P3114)
  -    Płytki
         - płytki 96-dołkowe (Z374903)
        - Płytki 384-dołkowe (Z374911)
  -    Uszczelki do płytek
        - Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)
        - Folia ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)

Uwagi do tego protokołu

• cDNA jest generowane przy użyciu zestawu ReadyScript^® RT zawierającego kombinację starterów losowych i oligo-dT (zob.nbsp;Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji (dwuetapowy) oraz odwrotna transkrypcja).
• Jeśli używasz płytki PCR, postępuj zgodnie ze schematem płytki, aby upewnić się, że mieszanina reakcyjna, próbki i kontrole są dodawane do właściwych studzienek.
• Testuj szeroki zakres genów, które mogą być potencjalnymi genami referencyjnymi. Powinny one ulegać ekspresji w różnych funkcjonalnych szlakach genowych. Wybór potencjalnych KiCqStart^® SYBR^® Primery f dla niektórych organizmów modelowych podano w 
  Tabeli P15-37.OligoArchitect jest odpowiednim narzędziem do projektowania alternatywnych starterów (patrz OligoArchitect™ Assay Design oraz PCR/qPCR/dPCR Assay Design).

Tabela P15-37 Potencjalni kandydaci na geny referencyjne i kody produktów KiCqStart^® (KSPQ12012)..

Gen referencyjny<	Mouse	Human	Rat
CANX	M_Canx_1	H_CANX_1	R_Canx_1
HPRT1	NA	H_HPRT1_1	R_Hprt1_1
PGK1	M_Pgk1_1	H_PGK1_1	R_Pgk1_1
TBP	M_Tbp_1	H_TBP_1	R_Tbp_1
YWHAZ	M_Ywhaz_1	H_YWHAZ_1	R_Ywhaz_1
ATP5B	M_Atp5b_1	H_ATP5B_1	R_Atp5b_1
SDHA	M_Sdha_1	H_SDHA_1	R_Sdha_1
TUBB2B	NA	H_TUBB2B_1	R_Tubb2b_1
UBC	M_Ubc_1	H_UBC_1	R_Ubc_1
PPIA	NA	H_PPIA_1	R_Ppia_1
GUSB	M_Gusb_1	H_GUSB_1	R_Gusb_1
GAPDH	NA	H_GAPDH_1	NA
TUBA1A	NA	H_TUBA1A_1	R_Tuba1a_1
ACTB	M_Actb_1	H_ACTB_1	R_Actb_1

Metoda

1.    Oblicz liczbę wymaganych reakcji dla każdego genu referencyjnego. Przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny dla dwóch reakcji na
       próbkę. Na przykład, jeśli testujesz 5 próbek testowych i 5 próbek kontrolnych, dwie kontrole bez szablonu (NTC) = 22 reakcje. Oblicz
       wystarczającą ilość dla 10% dodatkowych, aby uwzględnić błąd pipetowania.

2.Przygotować mieszaninę wzorcową qPCR dla każdej pary starterów genu referencyjnego zgodnie z Tabelą P15-38.Nie dodawać cDNA do
     mieszaniny wzorcowej. Dobrze wymieszaj i unikaj powstawania pęcherzyków powietrza.

Tabela P15-38 Mieszanina główna qPCR do selekcji genów referencyjnych.

Odczynniki	Objętość (μL na pojedynczą 20 μL reakcję
Objętość (μL) na pojedynczą 20 μL reakcję
2× KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™	10
Forward primer (10 μM)	0.9
Reverse primer (10 μM)	0.9
PCR grade Water	3.2

3.    Dodaj 15 μL mieszaniny wzorcowej do zdefiniowanych probówek/baseników.

4.    Dodaj 5 μL odpowiedniego wzorca (próbka lub woda dla NTC do zdefiniowanych probówek/baseników).

5.    Zakryj probówki lub uszczelnij płytki i oznakuj. (Upewnij się, że etykieta nie zasłania ścieżki światła wzbudzenia/detekcji urządzenia.)

6.    Przeprowadź reakcje zgodnie z poniższym trzyetapowym protokołem (Tabela P15-39). Kroki 1-3 są powtarzane przez 40 cykli.

7.  Analiza danych do analizy danych i określenia najbardziej stabilnego genu referencyjnego lub kombinacji genów.

Tabela P15-39 Warunki cyklu PCR dla selekcji genów referencyjnych.

Warunki cyklu	Temp.Czas (sek.)
Denaturacja początkowa/Hot Start	95	30
.Powtórzyć kroki 1-3 przez 40 cykli
Krok 1	95	5
Krok 2	58	10
Krok 3<	72	15

Uwaga: Używaj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych).