Protokół sprzęgania modyfikacji estrów NHS z oligonukleotydami znakowanymi aminami

Protokół ten służy do sprzęgania modyfikacji estrów NHS, takich jak TxRd (Sulforhodamine 101-X) (protokół jest skuteczny dla większości modyfikacji estrów NHS), z oligonukleotydem z etykietą aminową, taką jak 5'-Amino-Modifier C6 (Rysunek 1). Ponieważ TxRd (Sulforhodamine 101-X) i kilka innych modyfikacji są dostępne tylko jako estry NHS, muszą być ręcznie sprzężone z oligonukleotydami znakowanymi aminowo w oddzielnej reakcji po syntezie.

Rysunek 1. Przykładowa reakcja modyfikacji estrów NHS po syntezie z TxRd (Sulforhodamine 101-X) i oligonukleotydem 5'-Amino-Modifier C6.

Definicje / skróty

• DMSO - Dimetylosulfotlenek
• EtOH - Etanol
• HCl - Kwas solny
• NaCl - Kwas chlorowodorowy
• NaCl/etanol
• HCl - kwas solny
• NaCl - Chlorek sodu
• NaB - dekahydrat tetraboranu sodu (Na₂B₄O_{7 ּ}- 10H₂O)

Sprzęt

• Wytrząsarka laboratoryjna
• Wirówka z chłodzeniem (Eppendorf™ 5810R lub odpowiednik)
• Liofilizator lub wyparka odśrodkowa (do suszenia bez dostępu powietrza)

Zaopatrzenie

• 1 ml strzykawka
• igła o rozmiarze 20
• 2 ml probówki wirówkowe
• 50 ml probówki wirówkowe (opcjonalnie)
• Końcówki do pipet
• Pipety jednorazowe
• NaB (Product No. S9640)
• Milli-Q^® H₂O
• HCl (stężony)
• 100% EtOH (Nr produktu. E7023-4L) w temperaturze -70 °C
• 70% EtOH w temperaturze -20 °C
• 3M Bufor octanu sodu (Nr produktu. S7899-1L)
• NHS-ester modyfikacji wyboru
• Oligonukleotyd 5'-Amino-Modyfikator C6 z niestandardową sekwencją

Metoda

Proces koniugacji jest podzielony na dwa główne etapy: 1) reakcja koniugacji i 2) usunięcie nadmiaru wolnej modyfikacji NHS-estrowej poprzez wytrącanie po koniugacji.

Chociaż HPLC jest konwencjonalną metodą usuwania nadmiaru wolnej modyfikacji NHS-estrowej i niesprzężonego oligonukleotydu, inne procesy oczyszczania, np. wytrącanie, mogą być również skuteczne. Wytrącanie (opisane poniżej) usuwa większość, ale nie wszystkie pozostałe modyfikacje estrów NHS. W zależności od zastosowania, niesprzężona modyfikacja może stanowić problem. Chociaż nie będzie ona dalej reagować, ponieważ ester NHS jest hydrolizowany przez bufor, może przyczyniać się do szumu tła, a tym samym prowadzić do słabego stosunku S:N (jeśli modyfikacja jest barwnikiem, np. TxRd (Sulforhodamine 101-X) lub zmniejszać gęstość obciążenia powierzchniowego (jeśli modyfikacja służy do przyłączania, np. biotyna). Ponadto pozostanie niesprzężony oligonukleotyd.

Reakcja koniugacji

Zacznij od zalecanych warunków i zoptymalizuj w razie potrzeby. 

1. Przed użyciem upewnij się, że wszystkie odczynniki są rozmrożone, dokładnie wymieszane i odwirowane.
2. Znakowany aminowo oligonukleotyd rozpuścić w buforze koniugacyjnym, takim jak NaB pH 8,5, zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabeli 1. Końcowe stężenie oligonukleotydu będzie wynosić od 0,3 do 0,8 mM. Patrz Dodatkowe uwagi dotyczące przygotowania 50 ml 0,091 M buforu NaB.
3. Rozpuścić modyfikację estrową NHS w DMSO. Stężenie modyfikacji NHS-estrowej wynosi około 14 mM (może się różnić ze względu na zmienną masę cząsteczkową modyfikacji). Patrz Dodatkowe uwagi dotyczące przygotowania modyfikacji estrów NHS.
4. Dodaj zalecaną objętość modyfikacji estrów NHS do zalecanej objętości znakowanego aminowo oligonukleotydu zgodnie z wytycznymi w Tabeli 1. Delikatnie worteksować probówkę. Wskazane objętości zmieszczą się w probówce o pojemności 2 ml. W przypadku reakcji na większą skalę należy użyć wielu probówek o pojemności 2 ml lub probówki o pojemności 50 ml.
5. Wytrząsaj probówki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (około 25 °C). Odpowiednio ustawić prędkość wytrząsarki, aby uniknąć rozpryskiwania na ścianki probówki. Aby chronić barwniki przed fotobieleniem, przykryj probówki folią aluminiową.

Tabela 1 Przewodnik referencyjny koniugacji.

Ilość oligonukleotydów znakowanych aminami	Objętość buforu koniugacyjnego NaB	Objętość roztworu modyfikującego estry NHS	Objętość EtOH/octanu sodu do wytrącania
<30 OD	200 µL	50 µL	1 mL
>30 do 60 OD	600 µL	100 µL	2 mL

Wytrącanie po koniugacji

Wytrącanie po koniugacji przeprowadza się w probówce o pojemności 2 ml (50 ml w przypadku większej skali reakcji).

1. Dodaj objętość roztworu EtOH / 3M octanu sodu (9:1 V/V) do objętości reakcji koniugacji zgodnie z wytycznymi w Tabeli 1. Worteksować roztwór, aby zainicjować wytrącanie. Roztwór EtOH / 3M octanu sodu powinien być przygotowany na świeżo (dobry przez tydzień) przy użyciu absolutnego EtOH.
2. Wiruj probówkę przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Użyj 3000 obrotów na minutę dla wirówki typu Eppendorf 5810R lub 13 000 obrotów na minutę dla mikrowirówki.
3. Użyj jednorazowej pipety, aby usunąć supernatant. Nie pozwól, aby osad oderwał się od dna probówki.
4. Dodaj 500 µl zimnego 70% EtOH (-20 °C) i ostrożnie zawiruj wokół dna probówki. Nie worteksuj (osad powinien pozostać niezakłócony).
5. Wiruj przez 20 minut w temperaturze 4 °C, używając ustawienia RPM z kroku 2.
6. Użyj jednorazowej pipety, aby usunąć supernatant.
7. W razie potrzeby wykonać drugie płukanie EtOH (kroki 4-6).
8. Suszyć powietrzem, liofilizować lub odparować odśrodkowo.

Oligonukleotyd jest teraz sprzężony z modyfikacją i może być rozpuszczony w wodzie lub buforze do użycia w zamierzonym zastosowaniu.

Dodatkowe uwagi

Przygotowanie 50 mL 0.091 M NaB Buffer

1. Rozpuścić 1,735 g NaB w około 45 ml Milli-Q H₂O.
2. Pozwolić proszkowi całkowicie się rozpuścić przed dostosowaniem pH do 8,5 za pomocą HCl. Obniżyć pH, dodając HCl w porcjach 50 μl. Dokładnie wymieszaj roztwór, a następnie odpipetuj około 25 μL na pasek pH. Nie zanurzaj paska pH bezpośrednio w roztworze.
3. Dodaj Milli-Q H₂O do uzyskania 50 ml roztworu. Ponownie worteksuj roztwór.
4. Podawaj 1 ml roztworu do probówek o pojemności 2 ml aż do wyczerpania. Przechowuj probówki w temperaturze -20 °C, aby zminimalizować zmiany pH.

Inne bufory nieaminowe mogą być zastąpione przez NaB, o ile pH nie jest wyższe niż 8,5 (wyższe pH zbyt szybko zhydrolizuje ester NHS).

Przygotowanie modyfikacji estrów NHS

Modyfikacje estrów NHS są dostarczane jako bezwodne odczynniki w butelkach z hermetycznymi zamknięciami. Utrzymuj wilgoć z dala od estrów NHS przed dodaniem do roztworu buforowego oligonukleotydów znakowanych aminowo, ponieważ szybko hydrolizują. Użyj bezwodnego DMSO lub innego rozpuszczalnika.  

1. Modyfikacja estrów NHS powinna być przechowywana w temperaturze -20 °C. Upewnij się, że jest całkowicie rozmrożony w temperaturze pokojowej przed otwarciem butelki (nie używaj ciepła).
2. Przymocuj igłę o rozmiarze 20 do końcówki strzykawki o pojemności 1 ml. Użyj tej strzykawki, aby wyekstrahować żądaną objętość DMSO (użyj 100 µL na mg ciała stałego modyfikującego ester NHS; w zależności od modyfikacji może być konieczne dodatkowe DMSO). Użyj techniki "balonu", aby utrzymać butelkę z zapasem DMSO pod ciśnieniem azotu, a tym samym utrzymać wilgoć na zewnątrz.
3. Dodaj bezwodny DMSO do butelki z modyfikacją estrów NHS. Rozpuść proszek, delikatnie pipetując DMSO w górę i w dół, jednocześnie myjąc boki fiolki. Delikatnie worteksuj butelkę, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
4. Użyj modyfikacji od razu (przechowywanie nie jest zalecane).