Przejdź do zawartości
Merck
Strona głównaqPCRProtokół określania wydajności qPCR

Protokół określania wydajności qPCR

Przeczytaj o

Optymalizacja warunków qPCR

Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatur wyżarzania.

Po zoptymalizowaniu testu ważne jest, aby zweryfikować wydajność reakcji. Informacje te są ważne podczas raportowania i porównywania testów. W tym przykładowym protokole wydajność testu jest porównywana w szerokim i wąskim zakresie dynamicznym stężeń cDNA. W praktyce często wybiera się pojedynczy zakres do testowania w zależności od oczekiwanego zakresu celu w próbkach, więc podany protokół można dostosować do wymagań eksperymentu. W tym przykładzie wydajność jest obliczana przy użyciu zarówno 10-krotnych, jak i 2-krotnych serii rozcieńczeń. Krzywa standardowa powinna obejmować oczekiwany zakres ekspresji dla interesujących genów Należy zauważyć, że proporcjonalność wydajności cDNA w odniesieniu do wejściowego RNA jest liniowa podczas korzystania z zestawu ReadyScript® RT, więc ten eksperyment można dostosować do RT-qPCR, jeśli używa się tego systemu poprzez 1) rozcieńczenie RNA i przeprowadzenie reakcji RT, a następnie 2) przeprowadzenie qPCR na każdej z powstałych próbek cDNA (patrz Reverse Transcription dla przykładów).Nie zawsze jednak tak jest i nie dotyczy to wszystkich zestawów lub protokołów odwrotnej transkrypcji. Należy to zweryfikować przed dostosowaniem tego protokołu do alternatywnego zestawu 

Equipment

  • Quantitative PCR instrument
  • Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)

Odczynniki

  • DNA do wykorzystania jako szablon krzywej standardowej (np.g., cDNA, gDNA lub szablon syntetyczny).
  • KiCqStart SYBR® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03
  • PCR grade water: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) jako 20 ml podwielokrotności; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności dla każdej reakcji.
  • Startery do przodu i do tyłu dla badanych genów (zapas 10 μM). 
Tabela 1.Przewodnik wyboru SYBR® Green PCR Mix™.

Dostawy

Uwagi do tego protokołu

  • cDNA jest generowane przy użyciu losowego primingu lub metody oligo-dT (patrz Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji (dwuetapowy)). Produkt RT jest rozcieńczany w celu przygotowania krzywych standardowych (jako przykłady podano 1:2 i 1:10). RNA można również rozcieńczyć i zsyntetyzować cDNA z każdego rozcieńczenia przy użyciu zestawu ReadyScript® lub zastosować jednoetapowe podejście RT-qPCR, rozcieńczając RNA i postępując zgodnie z jednoetapowym podejściem RT-qPCR w Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowy SYBR® Green I Dye Detection) oraz Protokół odwrotnej transkrypcji (jednoetapowe wykrywanie sondy). Alternatywnie, szablony DNA można zastąpić w taki sposób, aby oczekiwany zakres Cq mieścił się w zakresie od Cq 15 do Cq 38.
  • Każde stężenie seryjnych rozcieńczeń zostanie przeprowadzone jako zduplikowane reakcje.

Metoda

1.    Przygotuj mieszaninę wzorcową qPCR wystarczającą na 40 reakcji zgodnie z Tabelą 2. Pozwala to na uwzględnienie dodatkowych błędów pipetowania, ponieważ zostaną przeprowadzone 32 reakcje (Tabela 3).

Tabela 2.Mieszanina wzorcowa do generowania krzywej wzorcowej 1:2 i 1:10.

2.    Rozcieńczyć DNA w serii 1:10 i 1:2 obejmującej 7 punktów rozcieńczenia dla każdej serii  (Tabela 3, Układ płytki do rozcieńczania DNA).

3.    Dodaj 5 μL odpowiedniego rozcieńczenia szablonu do określonych dołków (Tabela 3, Układ płytki do rozcieńczania DNA).

Tabela 3. Schemat pierwszych czterech kolumn układu płytki 96-dołkowej pokazujący położenie rozcieńczeń szablonu krzywej wzorcowej. Podane rozcieńczenie odnosi się do oryginalnego roztworu podstawowego. W przypadku korzystania ze sztucznej matrycy możliwe jest obliczenie liczby kopii (w odniesieniu do odczytów OD).

4.    Dodaj 15 μL mieszaniny wzorcowej do każdej studzienki (Tabela 3).

5.    Zakryj probówki lub uszczelnij płytkę i opatrz etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają wzbudzenia/detekcji urządzenia
     ścieżki światła).

6.    Uruchom próbki zgodnie z poniższym dwuetapowym protokołem. Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli. Śledź
       amplifikację ze standardową analizą krzywej dysocjacji.

.

Tabela 4.Warunki cyklu PCR dla generowania krzywej standardowej.

Uwaga: Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych).

Powiązane produkty
Loading
Powiązane artykuły
Powiązane kategorie produktów
Zaloguj się, aby kontynuować

Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.

Nie masz konta użytkownika?