Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji

Odwrotna transkrypcja

Odwrotna transkrypcja (RT) to proces przekształcania RNA w cDNA przy użyciu enzymu odwrotnej transkryptazy i dNTP.

Etap RT może być wykonywany na całkowitym RNA, dzięki czemu wytwarzany jest globalny cDNA, który jest reprezentatywny dla wszystkich transkryptów RNA w próbce (zwykle za pomocą protokołu dwuetapowego) lub w podejściu specyficznym dla genu, w którym tylko RNA będący przedmiotem zainteresowania jest przekształcany w cDNA (zwykle zgodnie z protokołem jednoetapowym).

Poniższe eksperymenty można wykorzystać jako podstawowe protokoły RT, które można modyfikować w celu spełnienia określonych wymagań. Zwyczajowo albo przygotowuje się cDNA przy użyciu dwuetapowego procesu z późniejszym rozcieńczeniem cDNA przed dodaniem go do PCR/qPCR, albo przygotowuje się jednoetapową reakcję, w której oba procesy są przeprowadzane sekwencyjnie.

Sprzęt

• Standardowy aparat PCR lub blok grzewczy
• Okap z przepływem laminarnym do konfiguracji RT (opcjonalnie)

Odczynniki

• RNA (roztwór podstawowy około 1 μg/μL).
• ReadyScript^® dwuetapowy zestaw do syntezy cDNA (RDRT). Alternatywne zestawy do odwrotnej transkrypcji mogą być również używane w połączeniu ze starterami oligo-dT i/lub starterami losowymi.
• Woda klasy PCR: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) w podwielokrotnościach 20 ml; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności do każdej reakcji.

Dostawy

• Filtr sterylny końcówki do pipet
• Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)
• Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z formatów:
  - Pojedyncze cienkościenne probówki PCR o pojemności 200 μL (Z374873 lub P3114)
  - Płytki
    - Płytki 96-dołkowe (Z374903)
    - Płytki 384-dołkowe (Z374911)
  - Uszczelki lub zakrętki do płytek
    - Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)
    - Folia ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)

Metoda

Przygotowanie

1. Umieść składniki zestawu ReadyScript^® i próbki RNA na lodzie.
2. Wymieszaj, a następnie krótko odwiruj, aby zebrać zawartość na dnie probówki.

Reakcja

1. Określ liczbę wymaganych reakcji, w tym kontroli. Oblicz objętość każdego składnika wymaganą dla wszystkich reakcji (pozostaw 10% więcej na błędy pipetowania) i połącz odczynniki zgodnie z Tabelą P10-26 używając probówek o pojemności 0,2 ml lub 96-dołkowej płytki z lodem. Jeśli używasz płytki PCR, postępuj zgodnie ze schematem płytki, aby upewnić się, że odczynniki są dodawane do odpowiednich studzienek.

Tabela P10-26. Mieszanina wzorcowa do syntezy cDNA ReadyScript^®

Odczynnik	Objętość (μL) na pojedynczą reakcję 20 μL
ReadyScript®cDNA Synthesis Mix (5× RT blend)	4
Total RNA template-variable (1 μg to 10 pg)	1
PCR grade water	15

2. Po zamknięciu każdej reakcji, delikatnie wymieszaj zawartość. Odwiruj krótko, aby zebrać składniki na dnie probówki reakcyjnej.
3. Inkubuj mieszaninę reakcyjną zgodnie z Tabelą P10-27.

.

Tabela P10-27. Profil temperatury inkubacji reakcji syntezy cDNA ReadyScript^®

Temperatura (°C)	Czas (min)
25	5
42	30
85	5
4	Hold

4. Po zakończeniu syntezy cDNA użyj 1:5 do 1:10 reakcji pierwszej nici (2-4 μL) do amplifikacji PCR.  
   Uwaga: przy użyciu odczynników ReadyScript^®, 2-4 μL nierozcieńczonego cDNA można dodać do PCR bez powodowania inhibicji. W razie potrzeby produkt cDNA można rozcieńczyć 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,1 mM EDTA i przechowywać w temperaturze -20 °C.

.