ChIP-qPCR i analiza danych

Quantitative real-time PCR (qPCR) pozwala na ilościowe określenie stężenia DNA z wielu próbek w czasie rzeczywistym poprzez analizę intensywności sygnału fluorescencyjnego, który jest proporcjonalny do ilości amplikonu po zakończeniu test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i oczyszczanie próbek. W qPCR próbki DNA są inkubowane ze starterami, polimerazami, oligonukleotydami i fluoroforami wykrywającymi, takimi jak sondy TaqMan®  (fluorescencyjna hybrydyzacja donor:quencher) lub SYBR®  zielony barwnik interkalujący (nie jest wymagana żadna konkretna sonda). Próbka DNA jest poddawana cyklom amplifikacji przez polimerazę DNA, w których produkty z poprzedniego cyklu stają się szablonami dla następnego cyklu, podwajając w ten sposób amplifikowane DNA w każdym cyklu, w najbardziej optymalnych reakcjach. Aby zapewnić pomyślną analizę, należy upewnić się, że startery amplifikują zamierzoną sekwencję z wydajnością powyżej 95% i że nie tworzą dimerów, które mogą zmniejszyć specyficzny sygnał qPCR oparty na technologii SYBR^® Green.

Czytaj więcej o

• Porównanie SYBR^® Green i TaqMan^® metod detekcji dla ChIP-qPCR
• Określenie wydajności reakcji qPCR
• Analiza danych ChIP-qPCR

Porównanie metod detekcji SYBR^® Green i TaqMan^® dla ChIP-qPCR

Dwie powszechnie stosowane metody detekcji dla qPCR to technologia SYBR^® Green oraz technologia sond TaqMan^® . SYBR^® Green jest barwnikiem wiążącym DNA, który drastycznie zwiększa fluorescencję po związaniu z dwuniciowym DNA. Sygnał fluorescencyjny wzrasta zatem wraz ze wzrostem liczby kopii dwuniciowego DNA. Wykrywanie można również osiągnąć za pomocą sond TaqMan^® . W tej metodzie fluorofor reporterowy i fluorofor wygaszający są włączone do pojedynczej, specyficznej dla sekwencji sondy, która rozpoznaje amplikon PCR. W wolnej sondzie sygnał z reportera jest wygaszany przez bliskość fluoroforu wygaszającego. Po hybrydyzacji z amplikonem, aktywność egzonukleazy 5'→3' polimerazy DNA degraduje sondę, uwalniając wolny fluorofor proporcjonalnie do ilości cząsteczek matrycy dostępnych do hybrydyzacji. W obu powyższych technikach qPCR sygnał fluorescencyjny podąża za fazą liniową, po której następuje faza plateau, gdy jeden ze składników reakcji staje się ograniczający szybkość.

	SYBR® Zielony barwnik	TaqMan®sonda
Detekcja	Wykrywa dwuniciowe DNA	Wykrywa amplikon poprzez hybrydyzację i degradację sondy
Przepustowość	Prosty cel	Możliwość multipleksowania
Wyzwanie techniczne	Umiarkowanie wysokie; wymaga dobrze zaprojektowanych starterów i sond oraz optymalizacji każdego zestawu starterów/sond
Koszt	+	++
Specyficzność	+ Może wykrywać niespecyficzne sygnały, takie jak dimery starterów i inne cząsteczki kwasów nukleinowych, które nie są przedmiotem zainteresowania.br />	++ Niskie, niespecyficzne wiązanie

Porada qPCR

Przed rozpoczęciem qPCR należy odwrócić wiązania krzyżowe w próbkach wejściowych i testowych za pomocą proteinazy K i ciepła. W niektórych przypadkach może być konieczne oczyszczenie DNA poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikiem (fenol:chloroform).

Sygnały fluorescencyjne wskazują próg cyklu (Ct)* dla każdej próbki. Ct to punkt fazy liniowej, w którym sygnał fluorescencyjny przekracza tło. Ct zależy od ilości DNA w próbce. Jeśli próbka zawiera stosunkowo duże ilości docelowego DNA, do przekroczenia tła wymagana będzie mniejsza liczba cykli, a wartość Ct będzie niska. I odwrotnie, jeśli ilość docelowego DNA jest niska, przed osiągnięciem Ct wystąpi więcej cykli. Analiza ChIP metodą qPCR działa najlepiej, gdy rozpoczyna się od bardziej rozcieńczonych próbek DNA (w przeciwieństwie do wysoce skoncentrowanych szablonów, które mogą hamować polimerazę Taq, gdy są obecne w wysokich stężeniach). Dlatego należy postępować zgodnie z dostępnymi protokołami opisującymi typowe objętości DNA ChIP do analizy metodą qPCR, takie jak 2 µl z 50 µl próbki ChIP, aby uniknąć wprowadzania inhibitorów PCR do reakcji.

*UWAGA: Aktualne wytyczne zawarte w "Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments" (MIQE) zalecają stosowanie "cyklu kwantyfikacji" (Cq) zamiast "progu cyklu" (Ct) podczas raportowania danych qPCR. Aby uzyskać więcej informacji na ten temat, a także zalecenia dotyczące odpowiednich kontroli, standardów analizy danych i raportowania błędów, odwiedź http://www.rdml.org/miqe.

Określanie wydajności reakcji qPCR q

Aby uzyskać znaczące informacje z analizy qPCR, ważne jest, aby zmierzyć pewne parametry w celu upewnienia się, że test działa prawidłowo. Najpierw należy sprawdzić wydajność (E) reakcji qPCR. Wydajność reakcji qPCR jest zwykle wyrażana jako wartość procentowa i wskazuje procent matrycy, która jest amplifikowana w każdym cyklu. Najlepszym sposobem na przetestowanie wydajności reakcji jest wygenerowanie krzywej standardowej poprzez wykonanie pięciopunktowych seryjnych rozcieńczeń próbki o znanym stężeniu i wykreślenie odpowiednich wartości Ct w celu wygenerowania krzywej standardowej.

Dla standardu DNA używanego do eksperymentów optymalizacji qPCR można użyć pofragmentowanego, oczyszczonego genomowego DNA lub, co wygodniejsze, DNA wyizolowanego z chromatyny jako próbki wejściowej. Próbka wejściowa może stanowić niewielki procent (2 do 5%) całkowitej próbki chromatyny. Próbka chromatyny powinna być trawiona proteinazą K, odwrócona krzyżowo i oczyszczona, aby zapewnić odpowiedni materiał kontrolny do opracowania testu lub obliczenia wydajności. W oprogramowaniu do oprzyrządowania qPCR wydajność jest często automatycznie obliczana i raportowana, jeśli wybierzesz typ próbki jako "Standardowy".

Wydajność reakcji można obliczyć za pomocą wzoru:

Wydajność (E) =10^{-1/nachylenie krzywej standardowej}

% Wydajność = (E-1) x 100

W przypadku zoptymalizowanej reakcji wydajność powinna wynosić od 95 do 105%. Jeśli wydajność nie mieści się w tym zakresie, może być konieczne zbadanie potencjalnych źródeł błędu eksperymentalnego:

1. Uruchom co najmniej trzy powtórzenia każdego rozcieńczenia i ewentualnie dostosuj rozcieńczenie
2. Użyj zoptymalizowanych buforów
   • a. Użyj komercyjnego mastermiksu, jeśli to możliwe, aby uzyskać bardziej spójne wyniki.
   • b. Uruchom próbkę niezawierającą DNA, aby przetestować bufory pod kątem zanieczyszczeń
3. Używaj dobrze zaprojektowanych starterów - idealnie, wartości Ct powinny wynosić od 18 do 30.
4. Jeśli wydajność jest nadal nieoptymalna, rozważ następujące możliwe przyczyny nieefektywności:
   • a. Amplikon jest zbyt duży (utrzymuj go w zakresie od 65 do 150 zasad)
   • b. Słaba integralność starterów (użyj świeżych starterów)
   • c. Primery zbyt skoncentrowane (zmień rozcieńczenie primerów, aby uniknąć dimerów)
   • d. Zanieczyszczenie fenolem, solami lub etanolem w matrycy DNA
   • e. Niewłaściwe ustawienia linii bazowej lub progu instrumentu
   • f. Zanieczyszczenie w kontroli bez matrycy (używaj dedykowanych pipet, sprzętu napromieniowanego promieniami UV, świeżej wody Milli-Q^® itp, i ustawić w oddzielnym pomieszczeniu)

ChIP-q Analiza danych qPCR

Istnieją dwa podejścia do analizy danych qPCR: kwantyfikacja bezwzględna i kwantyfikacja względna.

Absolutna kwantyfikacja

Absolutna kwantyfikacja pozwala określić, ile DNA znajduje się w danej ilości próbki, bez wykonywania analiz porównawczych z innymi próbkami. W przypadku tej analizy należy wykonać następujące czynności:

1. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbki o znanym stężeniu  (kwantyfikowane, oczyszczone wejściowe DNA)
2. Dołączyć co najmniej trzy powtórzenia dla każdego rozcieńczenia
3. Uruchomić te standardy wraz z próbką(ami) testową(ymi)
< li>Skonstruować wzorce.li>Skonstruuj krzywą standardową logarytmicznych ilości próbki w stosunku do wartości Ct uzyskanych z analizy qPCR
4. Wykonaj analizę regresji, aby określić równanie krzywej standardowej i użyj tego równania do obliczenia ilości DNA w nieznanej próbce (próbkach).

Ilość docelowego DNA w badanej próbce powinna mieścić się w liniowym zakresie dynamicznym testu qPCR. Jeśli tak nie jest, należy dostosować rozcieńczenia próbki standardowej i powtórzyć eksperyment.

Dopasowana wartość uzyskana z ekstrapolowanego pomiaru Ct może być zgłaszana jako "odzyskane nanogramy DNA", "procent danych wejściowych", "liczba kopii", "średnia ilość", a także inne odmiany opisujące liczbę cząsteczek.

Względna kwantyfikacja

W analizie względnej kwantyfikacji, badana próbka jest wyrażana jako krotna zmiana w stosunku do próbki kontrolnej (immunoprecypitowanej przy użyciu normalnej oczyszczonej IgG lub mock IP). Próbka testowa może być również wyrażona jako procent genu referencyjnego, o którym wiadomo, że utrzymuje stały poziom ekspresji w warunkach eksperymentu, podobnie jak w przypadku stosowania białka "housekeeping" w analizach Western blot lub cDNA genu housekeeping do analizy ekspresji qRT-PCR. Loci DNA, o których wiadomo, że nie są zajęte przez immunoprecypitowane białko (locus ujemne) mogą być używane w ten sposób jako gen referencyjny w porównaniu do znanych, zajętych, pozytywnych loci kontrolnych DNA.

1. Oblicz procent danych wejściowych dla każdego ChIP:
   %Input = 2^{(-ΔCt [znormalizowany ChIP])}
2. Normalizuj wartości ΔCt locus pozytywnego do locus negatywnego (ΔΔCt) odejmując wartość ΔCt uzyskaną dla locus pozytywnego od wartości ΔCt dla locus negatywnego:
   (^{ΔCt = ΔCt}pozytywne - ^ΔCtnegatywne)
3. Oblicz krotne wzbogacenie sekwencji locus pozytywnego w ChIP DNA w stosunku do locus negatywnego:
   Wzbogacenie krotne =2^ΔΔCt