Multipleksowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym
Multipleksowa reakcja qPCR wykorzystująca chemię opartą na sondach jest wymagającą aplikacją, która często wymaga rozległej optymalizacji i walidacji.
Połączenie wielokanałowego cyklera do PCR w czasie rzeczywistym Eppendorf® Mastercycler® ep realplex4< S do PCR w czasie rzeczywistym oraz zestawy KAPA PROBE FAST qPCR firmy Kapa Biosystems stanowią wiodące w branży rozwiązanie do wysokowydajnych, szybkich, multipleksowych reakcji qPCR bez konieczności przeprowadzania szeroko zakrojonej optymalizacji.
Wprowadzenie
Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie multipleksowej reakcji PCR umożliwiają szybką identyfikację, genotypowanie i kwantyfikację wielu celów DNA jednocześnie w jednej reakcji. Multiplex qPCR szczególnie dobrze nadaje się do zastosowań takich jak analiza ekspresji genów, genotypowanie SNP, zmienność liczby kopii (CNV), wykrywanie organizmów zmodyfikowanych genetycznie (GMO), wykrywanie patogenów i monitorowanie skuteczności leczenia farmakologicznego.
Zalety multiplex qPCR obejmują zwiększoną przepustowość, niższe koszty reakcji i oszczędność ograniczonego materiału próbki. Multiplex qPCR często wymaga znacznej optymalizacji, a poszczególne testy muszą zostać zwalidowane przed multipleksowaniem. Staranne zaprojektowanie testu ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia komplementarności starterów i zapewnienia wydajnej amplifikacji każdego docelowego amplikonu.
Multiplex qPCR wymaga urządzenia zdolnego do wielokanałowej detekcji i odczynnika qPCR zdolnego do utrzymania wysokiej wydajności reakcji wszystkich amplikonów w formacie multipleksowym. System Eppendorf® Mastercycler® ep realplex4 System PCR w czasie rzeczywistym jest wyposażony w ultraszybki termoblok z kontrolą Peltiera (ogrzewanie 6°C/s i chłodzenie 4°C/s), umożliwiający zakończenie 40-cyklowej reakcji qPCR w czasie krótszym niż 1 godzina. realplex4 jednostki Peltiera zapewniają również dokładną kontrolę temperatury, a także wysoką jednorodność bloku, niezbędne parametry dla wysokowydajnej reakcji qPCR. Moduł optyczny składa się z matrycy 96 diod LED, które są wstępnie wybrane i wyrównane tak, że wszystkie studzienki są wzbudzane równomiernie, eliminując wymóg pasywnego barwnika referencyjnego (np. ROX), używanego do normalizacji sygnałów fluorescencyjnych w wielu konwencjonalnych instrumentach qPCR. W rezultacie kanał zwykle wykorzystywany do pasywnego barwnika referencyjnego jest dostępny do multipleksowania. realplex4 wykorzystuje również technologię Photo Multiplier Tube (PMT) do wykrywania sygnału, najbardziej czułą i przystępną cenowo technikę wykrywania obecnie dostępną. Eppendorf® Mastercycler® ep realplex4 S jest systemem czterokanałowym i zapewnia pełną elastyczność multipleksu dzięki filtrom emisji odpowiadającym długości fali 520/550/580/605 nm.
KAPA PROBE FAST qPCR Kits od Kapa Biosystems zawierają gotową do użycia mieszaninę wzorcową do wysoce czułego i dokładnego PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych dla sekwencji sond. Zestawy są kompatybilne z różnymi sondami, w tym sondami TaqMan®, sondami FRET, sondami skorpionowymi i sygnalizatorami molekularnymi. Zestawy KAPA PROBE FAST qPCR zostały opracowane specjalnie do szybkiego qPCR, bez uszczerbku dla wydajności i powtarzalności reakcji. Zestawy są zoptymalizowane pod kątem wszechstronności i nadają się do szerokiego zakresu zastosowań, w tym ekspresji genów, genotypowania SNP i multipleksowania. Zestawy KAPA PROBE FAST qPCR są dostarczane z gorącym startem opartym na przeciwciałach, umożliwiającym krótki czas początkowej aktywacji w temperaturze 95 °C. Protokoły PCR wykorzystujące KAPA PROBE FAST opierają się na skróconych czasach przedłużania, które pozwalają na znaczne skrócenie czasu cyklu PCR bez ryzyka pogorszenia wydajności reakcji.
Metody
Aby zademonstrować możliwość przeprowadzania szybkiej multipleksowej reakcji qPCR bez pogorszenia wydajności reakcji, zestaw ośmiu 2-krotnych (Rysunek 1) lub czterech 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń (Rysunek 2) został poddany analizie z użyciem KAPA PROBE FAST.) lub czterech 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń ludzkiego genomowego DNA amplifikowano przy użyciu pojedynczych (Rys. 2) lub dupleksowych (Rys. 3) testów i protokołu szybkiego cyklu (3 min w 95 °C początkowej aktywacji, 40 cykli po 3 s w 95 °C i 20 s w 60 °C). Amplifikację przeprowadzono w pełnych płytkach Eppendorf® Twin.tec z optycznie przezroczystą folią termozgrzewalną przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym realplex4 S. W badaniu wykorzystano dwa testy qPCR oparte na sondach hydrolizy (Tabela 1). Kalibrację barwnika dla testu Cal Fluor® Gold 540 TaqMan przeprowadzono zgodnie z opisem firmy Biosearch Technologies.
Wynikowe wykresy log amplifikacji i krzywe standardowe dla każdego testu przeprowadzonego oddzielnie (Rys. 2) i w dupleksie (Rys. 3) wskazują, że ani próg cyklu (CT), ani wydajność reakcji qPCR nie zostały naruszone w wyniku formatu multipleksowego. Różnice w średnich wartościach CT (ΔCT) dla każdego z czterech 4-krotnych rozcieńczeń zarówno w reakcjach pojedynczych, jak i dupleksowych wskazują na porównywalną wydajność między reakcjami pojedynczymi i dupleksowymi (Tabela 2). Szybki protokół zapewnia oszczędność czasu wynoszącą 56 minut w porównaniu z konwencjonalnym powolnym protokołem (10 minut przy początkowej aktywacji w temperaturze 95 °C, 40 cykli po 15 sekund w temperaturze 95 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C), gdy jest wykonywany w systemie PCR w czasie rzeczywistym realplex4 S.
.
Rysunek 1.Uzyskano wysoce powtarzalne i wydajne wyniki dla obu amplikonów w 8-punktowej serii rozcieńczeń ludzkiego genomowego DNA, gdy testowano je w dupleksie przy użyciu protokołu szybkiego cyklu. Krzywe standardowe zostały wygenerowane przy użyciu 2-krotnych rozcieńczeń ludzkiego genomowego DNA (40 - 0,3125 ng na 20 μL reakcji), testowanych w czterech powtórzeniach.
Rysunek 2.Pojedyncze reakcje qPCR. Dane przedstawiające wykresy logarytmiczne amplifikacji zestawu czterech 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń hgDNA w zakresie od 40 do 0,625 ng na reakcję przy użyciu szybkiego 2-etapowego protokołu cyklicznego. Dane reprezentują cztery powtórzenia dla każdego rozcieńczenia DNA. Testy ActB i ERBB2 są pokazane odpowiednio na zielono i pomarańczowo.
Rysunek 3.Dupleksowe reakcje qPCR. Dane przedstawiające wykresy logarytmicznej amplifikacji zestawu czterech 4-krotnych seryjnych rozcieńczeń hgDNA w zakresie od 40 do 0,625 ng na reakcję przy użyciu szybkiego 2-etapowego protokołu cyklicznego. Dane reprezentują cztery powtórzenia dla każdego rozcieńczenia DNA. Testy ActB i ERBB2 są pokazane odpowiednio na zielono i pomarańczowo.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?