Test immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Co to jest test ChIP?

Testy immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) są wykorzystywane do oceny interakcji czynnik transkrypcyjny-DNA i mają kluczowe znaczenie dla postępów w badaniach nad regulacją ekspresji genów i modyfikacjami epigenetycznymi. ChIP może wykrywać i względnie określać ilościowo specyficzne interakcje białko-DNA i białko-białko in vivo w pojedynczym locus lub wielu loci. ChIP obejmuje chemiczne sieciowanie białek z sekwencjami DNA, po którym następuje immunoprecypitacja usieciowanych kompleksów (rysunek 1) i analiza powstałego DNA za pomocą końcowej lub ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (rysunki 2-4), mikromacierzy (ChIP-chip) lub sekwencjonowania następnej generacji (ChIP-seq) (rysunki 5 i 6).

Przebieg testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP)

Rysunek 1. Przebieg procedury ChIP

Song et al., 2015

Białko i związana z nim chromatyna w żywych komórkach lub tkankach są sieciowane przy użyciu formaldehydu. Usieciowane kompleksy DNA-białko (chromatyna-białko) są następnie ścinane na fragmenty DNA o wielkości ∼500 bp przy użyciu trawienia enzymatycznego lub fizycznego ścinania za pomocą sonikacji. Kompleksy DNA-białko są następnie immunoprecypitowane przez odpowiednie przeciwciało specyficzne dla białka. Po odwróceniu wiązań krzyżowych powiązane fragmenty DNA są eluowane, po czym następuje immunoprecypitacja usieciowanych kompleksów i analiza powstałego DNA za pomocą końcowej lub ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR), mikromacierzy (ChIP-chip) lub sekwencjonowania nowej generacji (ChIP-seq).

Testy ChIP mogą być wykorzystywane do następujących badań:

• Sekwencje DNA zajmowane przez wiele specyficznych białek docelowych
• Miejsca wiązania i dystrybucja określonego białka, takiego jak czynniki transkrypcyjne, kofaktory transkrypcji, czynniki replikacji DNA i białka naprawy DNA w całym genomie, w określonych warunkach komórkowych
• Transkrypcja genów i aktywność polimerazy
• Złożone interakcje DNA/białko leżące u podstaw fenotypów chorobowych
• Modyfikacje białek, takich jak histony, które mogą wpływać na strukturę chromatyny i ekspresję genów
• Architektura nukleosomów i regulacja utrzymania chromosomów

ChIP wzbogacanie sekwencji DNA z komórek

Rysunek 2. ChIP z próbkami linii komórkowych.

Górny panel: Udane wzbogacenie ChIP sekwencji DNA związanych z białkiem heterochromatyny 1d gamma (HP1gamma), ważnym markerem represji genów. Dane zebrane przy użyciu zestawu przeciwciał/primeru ChIPAb+™ Hp1gamma, mysiej IgG (kontrola niespecyficzna) i zestawu Magna ChIP™ G (nr produktu 17-10085).

Dolny panel: Wysokoprzepustowa (96-dołkowa płytka) analiza ChIP wielu docelowych białek w celu wyszukiwania loci genowych w różnych warunkach przy użyciu paneli przeciwciał i zestawu Magna ChIP™ HT96 (nr produktu 17-10077).

Efektywne testy ChIP z wykorzystaniem próbek tkanek

Rysunek 3. ChIP z próbkami tkanek.

Panel górny: Kriosekcja tkanki i wyizolowanie próbki tkanki specyficznej dla regionu za pomocą dostarczonego 1 mm stempla do mikrodysekcji. Przykład izolacji tkanki specyficznej dla regionu jest pokazany na obrazku. 300 µm przekrój koronalny mózgu myszy z mikrodysekcją specyficzną dla regionu hipokampa (A) i kory mózgowej (B). Wyizolowaną tkankę umieszczono nad wyciętym regionem (a: hipokamp, b: kora mózgowa). Oczyszczona tkanka jest następnie rozpraszana roztworem stabilizującym tkanki, a następnie poddawana działaniu formaldehydu. Formaldehyd sieciuje białka z DNA, aby zapewnić współstrącanie.

Dolny panel: Chromatyna z różnych linii komórkowych została poddana immunoprecypitacji ze wskazanymi przeciwciałami przy użyciu zestawu Magna ChIP™ G Tissue (nr produktu 17-20000). IgG stosowane do względnego porównania było albo króliczym oczyszczonym IgG (nr produktu PP64B) lub mysim oczyszczonym IgG (nr produktu 12-371B), w zależności od przeciwciała ChIP. Dane ilościowego PCR przedstawiono jako krotność względnego wzbogacenia w IgG z niezależnych eksperymentów lub jako % danych wejściowych. Dla biologicznej kontroli negatywnej, qPCR oceniano za pomocą starterów przed genem Dhfr (UpSt (-)). Zastosowano następujące przeciwciała i startery: Anti-RNA Polymerase II clone CTD4H8 (Product No. 05-623B): 1 µg mysiego monoklonalnego przeciwciała oczyszczonego metodą powinowactwa immunoprecypitowanego z chromatyną różnych tkanek myszy i poddanego qPCR ze starterami specyficznymi dla mysiego promotora GAPDH i Anti-SP1 (Product No. 07-645): 1 µg mysiego monoklonalnego przeciwciała oczyszczonego przez powinowactwo, immunoprecypitowanego z chromatyny różnych tkanek myszy i poddanego testowi qPCR ze starterami specyficznymi dla mysiego promotora Dhfr.

Większe wzbogacenie fałdu przy użyciu małej ilości chromatyny lub krótszy czas procedury testu ChIP

Rysunek 4. Nasze zestawy zapewniają większe wzbogacenie przy użyciu niewielkich ilości chromatyny lub krótszej procedury niż zestawy innych dostawców.

Górny panel: 10 000 równoważników komórkowych sonikowanej chromatyny przygotowanej z komórek HeLa poddano immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu 1 µg oczyszczonej IgG (królicza IgG, nr produktu. 12-370) lub specyficznych przeciwciał (H3K4Me3, nr produktu 17-614; Phospho-CREB, nr produktu 17-10131). W każdym teście wykorzystano odczynniki i protokół dostarczony z zestawem Magna ChIP™ HiSens Kit (nr produktu 17-10460) lub te z niskonakładowego zestawu ChIP od dostawcy A lub dostawcy D. Immunoprecypitację fragmentów DNA związanych z przeciwciałem zweryfikowano za pomocą qPCR przy użyciu starterów kontroli pozytywnej (startery promotora GAPDH dla H3K4me3 i startery promotora c-Fos dla pCREB) i starterów kontroli negatywnej (startery promotora ludzkiej ß-globiny). Wyniki odzwierciedlają analizę 2 µL z 50 µL całkowitego DNA na reakcję qPCR.

Dolny panel: Kompletna reakcja ChIP w ciągu 6 godzin w elastycznym formacie dołka dla Imprint® Chromatin Immunoprecipitation Kit (nr produktu ChIP1) Porównanie czasu wymaganego do ukończenia protokołu od utrwalenia do oczyszczenia przy użyciu różnych zestawów do immunoprecypitacji chromatyny. Każdy eksperyment ChIP przeprowadzono przy użyciu protokołu zalecanego przez każdego producenta i porównano całkowity wymagany czas. Komórki HeLa zostały policzone, utrwalone i poddane immunoprecypitacji zgodnie z biuletynem Imprint CHP1 z opcjonalną metodą wysokiej czułości. Testy ChIP przeprowadzono przy użyciu anty-H3K9ac (H9286) i dostarczonych w zestawie przeciwciał przeciwko ludzkiej polimerazie RNA II i niespecyficznej mysiej IgG. Aby ocenić wzbogacenie ChIP, przeprowadzono SYBR qPCR ukierunkowany na region promotora GAPDH (gen podtrzymujący o wysokiej ekspresji). Procent wejścia opisuje ilość DNA z i bez selekcji przeciwciał. W przypadku tych przeciwciał pozorne wzbogacenie wzrosło wraz z mniejszą liczbą komórek na reakcję z powodu zmniejszonego niespecyficznego ściągania.

ChIP DNA analizowany przez sekwencjonowanie następnej generacji (ChIP-seq)

Rysunek 5. Analiza ChIP-Seq

Immunoprecypitację chromatyny przeprowadzono przy użyciu zestawu Magna ChIP™ HiSens (nr produktu 17-10460), 2 µl, 2 µg lub 5 µg przeciwciała anty-H3K4me2 (nr produktu. 04-790, 05-1338 lub ABE250) lub 1 lub 3 µL lub 4 µg przeciwciała anty-H3K4me3 (Nr produktu. 05-745R, 07-473 lub 05-1339), lub 2 µg przeciwciała anty-H3K36me3 (Nr produktu. ABE435), 20 µl kulek magnetycznych Protein A/G i 1e6 lub 4e6 lub 5e6 usieciowanej chromatyny komórek HeLa, a następnie oczyszczono DNA. Biblioteki zostały przygotowane z próbek Input i ChIP DNA przy użyciu standardowych protokołów z adapterami Illumina z kodem kreskowym i analizowane na instrumencie Illumina HiSeq™. Ponad dwanaście milionów odczytów z plików FastQ zmapowano za pomocą programu Bowtie (http://bowtiebio.sourceforge.net/manual.shtml) po usunięciu tagów TagDust (http://genome.gsc.riken.jp/osc/english/dataresource/). Piki zostały zidentyfikowane przy użyciu MACS (http://luelab.dfci.harvard.edu/MACS/), z pikami i odczytami wizualizowanymi jako niestandardowa ścieżka w UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu) z plików BigWig i BED. Najwyższe 25% pików zidentyfikowanych w danych wykazało 90-99% pokrycie z pikami zidentyfikowanymi w ścieżkach ENCODE H3K4me2 lub H3K4me3 lub H3K36me3 BROAD Histone dla HeLa S3. Pokazano dane w regionie transkrypcyjnie aktywnego genu podtrzymującego TUBA1A (tubulina, alfa 1A), HOXB, ACTB lub GAPDH.

Test ChIP i sekwencjonowanie następnej generacji przy użyciu niewielkich ilości DNA

Rysunek 6. Skuteczne ChIP i niezawodne tworzenie bibliotek sekwencjonowania następnej generacji z ograniczonych ilości DNA.

Biblioteki sekwencjonowania następnej generacji zostały skonstruowane z DNA Sp1 ChIP przy użyciu 10 ng (górny panel) lub 1 ng kwantyfikowanego immunoprecypitowanego DNA (środkowy panel). Bibliotekę referencyjną utworzono przy użyciu 10 ng oczyszczonego DNA z chromatyny wejściowej. Próbki przygotowano przy użyciu zestawu Magna ChIP-Seq Kit (nr produktu  17-1010) i zestawu przeciwciał/primerów ChIPab+ Sp1 (nr produktu  17-601). Powstałe biblioteki zostały zsekwencjonowane na urządzeniu Illumina Genome Analyzer, a następnie wyrównane i zmapowane do ludzkiego genomu referencyjnego hg18. Powyżej przedstawiono wynikową analizę pików (uzyskaną przy użyciu QuEST) locus Sp1 z pewnie zmapowanych odczytów przeglądanych za pomocą oprogramowania DNAnexus™. Porównano powtórzone przebiegi sekwencjonowania z bibliotek 10 ng i 1 ng, wykazując nakładającą się identyfikację pików w promotorze genu Sp1. Trójkąty odzwierciedlają zdarzenia wiązania Sp1 o wysokim prawdopodobieństwie związane głównie w pobliżu miejsc startu transkrypcji w tym przedziale genomowym.

Przewodniki po eksperymentach ChIP, FAQ, porady dotyczące rozwiązywania problemów i protokoły uzupełniające

ChIP może stanowić wyzwanie nawet dla najbardziej doświadczonych badaczy. Jest to wieloetapowa technika (rysunek 1), która wymaga wysokiej jakości chromatyny, solidnych przeciwciał, zoptymalizowanych odczynników i protokołów w celu uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników. Zazwyczaj osiąga się to poprzez stosowanie komercyjnie przygotowanych produktów i protokołów lub przeprowadzanie wielu eksperymentów walidacyjnych. Niezależnie od preferowanej strategii, poniżej znajdują się kompleksowe przewodniki po eksperymentach ChIP, które pomogą Ci rozwiązać niektóre z problemów często napotykanych w ChIP, od przygotowania próbki do dalszej analizy DNA.

• Przewodniki po liczbie komórek dla ChIP i analizy punktu końcowego
• Kulki agarozowe vs. kulki magnetyczne
• Sieciowanie białek do DNA i liza komórek
• immunoprecypitacja, przemywanie i elucja
• ChIP-qPCR i analiza danych (% input i fold enrichment)
• Guide to peak calling for ChIP-Seq
• FAQs (Antibodies, fusion tag, cross-link and beads, chromatin fragmentation and data analysis)
• Wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów (wysokie tło, niski odzysk DNA, brak amplifikacji DNA, pobieranie tylko dużych DNA, niespecyficzny osad DNA)
• Protokoły uzupełniające

Który zestaw ChIP jest odpowiedni dla Ciebie?

Standardowe zestawy ChIP

Product No. /Opis	Czas testu (dzień)	Rodzaj kulek (białko A lub G)	Agarozowe lub magnetyczne	Koktajl inhibitorów/proteinazy K	Kolumny wirówkowe	Kontrola IgG/qPFKoktajl inhibitorów/ Proteinaza K	Kolumny wirówkowe	Kontrolne IgG/qPCR Primery
17-10460 Magna ChIP™ HiSens Chromatin Immunoprecipitation Kit	1	A+G	Magnetic	-
Highlight: 1) Solidny ChIP od zaledwie 10 000 do nawet 1 000 000 komórek; 2) Pojedynczy system buforowy (bufor SCW) dla wielu etapów sonikacji, IP chromatyny i płukania; 3) Bufor do elucji ChIP opracowany w celu umożliwienia analizy wzbogacania za pomocą qPCR bez dodatkowych etapów oczyszczania w celu uzyskania szybszych wyników; 4) sprawdzony zarówno w analizie qPCR, jak i ChIP-seq (rys. 5 i 6)
17-10461 Magna ChIP™ A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	1	A+G	Magnetic	-		-
Highlight: 1) Solidny ChIP od zaledwie 10 000 do nawet 1 000 000 komórek; 2) Pojedynczy system buforowy (bufor SCW) dla wielu etapów sonikacji, IP chromatyny i płukania; 3) Bufor do elucji ChIP opracowany w celu umożliwienia analizy wzbogacania za pomocą qPCR bez dodatkowych etapów oczyszczania w celu uzyskania szybszych wyników; 4) sprawdzony zarówno w analizie qPCR, jak i ChIP-seq (rys. 5 i 6)
17-10085 Magna ChIP™ A/G Chromatin Immunoprecipitation Kit	1	A+G	Magnetic	-	-
Highlight: Nr. cytowań: 92
17-10086 Zestaw do immunoprecypitacji chromatyny EZ-Magna ChIP™ A/G	1	A+G	Magnetyczny	-	-	-
Podświetlenie: Liczba cytowań: 86
17-610 Zestaw do immunoprecypitacji chromatyny Magna ChIP™ A	1	A	Magnetic	-	-
17-408 Zestaw do immunoprecypitacji chromatyny EZ-Magna ChIP™ A	1	A	Magnetic	-	-	-
17-611 Magna ChIP™ G Chromatin Immunoprecipitation Kit	1	G	Magnetic	-	-
17-409 Zestaw do immunoprecypitacji chromatyny EZ-Magna ChIP™ G	1	G	.Magnetyczny	-	-	-
Highlight: No. cytowań: 41
CHP1 . Imprint® Chromatin Immunoprecipitation Kit	1<	G	Agarose	-	-	-
Podkreślenie: 1) Nr. cytowań: 33; 2) Najkrótszy czas procedury
17-20000 Magna ChIP™ G Tissue Kit	2	G	Magnetic	-	-	-
Highlight: 1) Nadaje się do testów ChIP z próbek tkanek i udowodnionej wydajności w sercu, płucach, korze mózgowej i nerkach; 2) Mikrodyssektowane funkcjonalnie powiązane populacje komórek w heterogenicznej tkance mogą być analizowane z łatwością, precyzją i pewnością; 3) Nr. cytowań: 32
17-295 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit	2	A	Agaroza
Highlight: 1) Nr. cytowań: 137; 2) Zawierający białko A Agarose/Salmon Sperm DNA (nr kat.: 16-157) do blokowania niespecyficznych miejsc wiązania DNA na kulkach agarozowych
17-371 EZ-ChIP™	2	G	Agarose	-	-	-
Highlight: Nr. cytowań: 1,757
CHP2NC Imprint® Ultra Chromatin Immunoprecipitation Kit, Without Controls	2	A	StaphA	-	-	-
Highlight: Odpowiedni dla czynników transkrypcyjnych o niskiej, średniej i wysokiej ekspresji, a także modyfikacji histonów. Solidny ChIP dla szerokiego zakresu liczby komórek od 2 do 10 milionów.

Specjalistyczne zestawy ChIP

Kat. #/opis	liczba testów	Czas testu (dzień)	Rodzaj kulek (białko A lub G)	Agarozowe lub magnetyczne	Bufory	Koktajl inhibitorów/ Proteinaza K	Kolumny wirówkowe	Kontrolne IgG/qPCR Primery
17-10077 Magna ChIP™ HT96 Chromatin Immunoprecipitation Kit	96	1	A+G	Magnetyczny	-	-
17-10078 EZ-Magna ChIP™ HT96 Chromatin Immunoprecipitation Kit	96	1	A+G	Magnetic	-	-		-
17-245 Acetyl-Histone H3 Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit	22	2	A	Agaroza	-
17-229 Acetyl-Histone H4 Immunoprecipitation (ChIP) Assay Kit	22	2	A	Agaroza	-
17-1010 Magna ChIP-Seq™ Chromatin Immunoprecipitation and Next Generation Sequencing Library Preparation Kit	10	.2	A+G	Magnetic	-	-	-	-
17-1000 Magna ChIP2 ™ Universal Chromatin Immunoprecipitation DNA Microarray Kit	2	2	A+G	Magnetic	-	-	-
17-1004 Magna ChIP2 ™ Universal Chromatin Immunoprecipitation DNA Microarray Quad Kit	12	2	A+G	Magnetic	-	-	-
17-1002 Magna ChIP2 ™ Chromatin Immunoprecipitation Mouse Promoter 244K Microarray Kit	3 (6 slajdów)	2	A+G	Magnetic	-	-

Akcesoria ChIP

Nr kat.	Opis	Typ kulek (białko A lub G)	Agarozowe lub magnetyczne
16-661	Magna ChIP™ Protein A Magnetic Beads	A	Magnetic
16-661X	Magna ChIP™ Protein A Magnetic Beads -Trial Size	A	Magnetic
16-662	Magna ChIP™ Protein G Magnetic Beads	G	Magnetic
16-662X	Magna ChIP™ Protein G Magnetic Beads -Trial Size	G	Magnetic
16-663	Magna ChIP™ Protein A+G Magnetic Beads	A+G	Magnetic
16-663X	Magna ChIP™ Protein A+G Magnetic Beads	A+G	Magnetic
17-375	EZ-Zyme™ Chromatin Prep Kit
16-157	Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA	A	Agarose
16-201	Protein G Agarose/Salmon Sperm DNA	G	Agarose
LSKMAGS08	PureProteome™ Magnetic Stand
20-400	Magna GrIP™ Rack (8 well)