Separacja przez wirowanie

Mark Frei

BioFiles v6 n5, 6–7

Techniki wirowania

Istnieją dwa rodzaje technik wirowania do oddzielania cząstek: wirowanie różnicowe i wirowanie w gradiencie gęstości. Wirowanie w gradiencie gęstości można dalej podzielić na wirowanie strefowe i izopikniczne.

Wirowanie różnicowe
Wirowanie strefowe
Wirowanie izopikniczne
Wybór pożywki o odpowiednim gradiencie gęstości

Wirowanie różnicowe

Najprostszą formą separacji przez wirowanie jest wirowanie różnicowe, czasami nazywane granulowaniem różnicowym (Rysunek 1). Cząsteczki o różnych gęstościach lub rozmiarach w zawiesinie będą sedymentować z różną szybkością, przy czym większe i gęstsze cząsteczki będą sedymentować szybciej. Szybkość sedymentacji można zwiększyć za pomocą siły odśrodkowej. Zawiesina komórek poddana serii cykli zwiększania siły odśrodkowej da serię granulek zawierających komórki o malejącej szybkości sedymentacji.

Rysunek 1. Wirowanie różnicowe

Cząsteczki o różnej gęstości lub wielkości będą sedymentować z różną szybkością, przy czym największe i najbardziej gęste cząsteczki będą sedymentować najszybciej, a następnie mniej gęste i mniejsze cząsteczki.

Różnicowe granulowanie jest powszechnie stosowane do zbierania komórek lub wytwarzania surowych frakcji subkomórkowych z homogenatu tkankowego. Na przykład, homogenat wątroby szczura zawierający jądra, mitochondria, lizosomy i pęcherzyki błonowe, który jest odwirowywany z niską prędkością przez krótki czas, będzie granulował głównie większe i bardziej gęste jądra. Późniejsze wirowanie przy wyższej sile odśrodkowej spowoduje osadzenie cząstek o kolejnym niższym rzędzie wielkości (np. mitochondria) i tak dalej. Niezwykłe jest stosowanie więcej niż czterech cykli wirowania różnicowego dla homogenatu normalnej tkanki.

Z powodu niejednorodności cząstek biologicznych, wirowanie różnicowe cierpi na zanieczyszczenia i słabe odzyski. Zanieczyszczeniu różnymi typami cząstek można zaradzić poprzez ponowne zawieszenie i powtórzenie etapów wirowania (tj, płukanie osadu).¹

Wirowanie strefowe

.W wirowaniu strefowym można uniknąć problemu zanieczyszczenia krzyżowego cząstek o różnej szybkości sedymentacji, nakładając próbkę jako wąską strefę na gradient gęstości (Rysunek 2). W ten sposób szybciej sedymentujące cząstki nie są zanieczyszczane przez wolniejsze cząstki, jak ma to miejsce w przypadku wirowania różnicowego. Jednak wąska strefa obciążenia ogranicza objętość próbki (zwykle 10%), którą można umieścić w gradiencie gęstości. Gradient stabilizuje pasma i zapewnia medium o rosnącej gęstości i lepkości.

Rysunek 2. Wirowanie strefowe z szybkością

Próbka jest ułożona warstwowo jako wąska strefa na szczycie gradientu gęstości (2B). Pod wpływem siły odśrodkowej cząstki poruszają się z różną prędkością w zależności od ich masy (2C).

Prędkość, z jaką osadzają się cząstki, zależy przede wszystkim od ich wielkości i masy, a nie gęstości. Gdy cząstki w paśmie poruszają się w dół przez ośrodek gęstości, tworzą się strefy zawierające cząstki o podobnej wielkości, ponieważ szybciej sedymentujące cząstki poruszają się przed wolniejszymi. Ponieważ gęstość cząstek jest większa niż gęstość gradientu, wszystkie cząstki ostatecznie utworzą osad, jeśli będą odwirowywane wystarczająco długo.²

.Wirowanie izopikniczne

W separacji izopiknicznej, zwanej również separacją wyporową lub równowagową, cząstki są oddzielane wyłącznie na podstawie ich gęstości. Rozmiar cząstek wpływa tylko na szybkość, z jaką się poruszają, dopóki ich gęstość nie będzie taka sama jak gęstość otaczającego gradientu. Gęstość ośrodka gradientowego musi być większa niż gęstość cząstek, które mają zostać rozdzielone. Dzięki tej metodzie cząstki nigdy nie osiądą na dnie probówki, bez względu na to, jak długi jest czas wirowania (Rysunek 3).

Rysunek 3. Wirowanie izopikniczne

Zaczynając od jednorodnej mieszaniny próbki i gradientu gęstości (3A) pod wpływem siły odśrodkowej, cząstki poruszają się, aż ich gęstość jest taka sama jak otaczającego ośrodka (3B).

Po odwirowaniu cząstki o określonej gęstości osadzają się, aż osiągną punkt, w którym ich gęstość jest taka sama jak ośrodka gradientu (tj, położenie równowagi). Mówi się wtedy, że gradient jest izopikniczny, a cząstki są oddzielane zgodnie z ich wypornością. Ponieważ gęstość cząstek biologicznych jest wrażliwa na ciśnienie osmotyczne gradientu, separacja izopikniczna może się znacznie różnić w zależności od zastosowanego medium gradientowego. Chociaż gradient ciągły może być bardziej odpowiedni do celów analitycznych, techniki preparatywne powszechnie wykorzystują gradient nieciągły, w którym cząstki łączą się na granicy między warstwami gradientu gęstości. Ułatwia to zbieranie niektórych cząstek biologicznych (np, limfocyty) łatwiejsze.

Wybór odpowiedniej pożywki w gradiencie gęstości

Podstawową funkcją wirowania w gradiencie gęstości jest oddzielanie cząstek na podstawie ich gęstości wyporu lub szybkości sedymentacji. W przypadku separacji strefowej funkcja gradientu polega na zapewnieniu gradientu lepkości, który poprawia rozdzielczość cząstek, jednocześnie stabilizując kolumnę przed prądami konwekcyjnymi. W przypadku separacji izopiknicznej ważną cechą jest to, że maksymalna gęstość mediów gradientowych jest wyższa niż gęstość cząstek. Idealny nośnik z gradientem gęstości ma następujące właściwości:³

• Wystarczająca rozpuszczalność do wytworzenia wymaganego zakresu gęstości
• Nie tworzy roztworów o wysokiej lepkości w pożądanym zakresie gęstości
• Nie jest hiperosmotyczny lub hipoosmotyczny, gdy cząstki, które mają być rozdzielone, są wrażliwe osmotycznie
• Roztwory gradientu powinny być regulowane do pH i siły jonowej, które są zgodne z rozdzielanymi cząstkami
• Nie wpływa na aktywność biologiczną próbki
• Nietoksyczny i nie metabolizowany przez komórki
• Nie zakłóca procedur testowych ani nie wchodzi w reakcję z probówkami wirówkowymi
• Wykazuje właściwości, które można wykorzystać jako miarę stężenia
• Łatwo usuwa się z oczyszczonego produktu
• Autoklawowalny
• Rozsądny koszt

Żaden pojedynczy związek nie może spełnić wszystkich powyższych kryteriów. Dlatego dla różnych rodzajów próbek stosuje się szeroki zakres mediów gradientowych (Tabela 1). Większość nośników jest w stanie wytworzyć wymagany zakres gęstości i można je łatwo usunąć z cząstek będących przedmiotem zainteresowania.

.Osmolalność i cząsteczki biologiczne

Wpływ osmolalności na cząsteczki biologiczne wymaga szczególnej uwagi. Osmolalność większości płynów ssaków wynosi 290-300 mOsm.⁴ Jest to osmolalność zrównoważonych roztworów soli (np. 0,85-0,9% NaCl) i większości popularnych mediów. Roztwory o wysokiej osmolalności nie tylko usuwają wodę z wnętrza cząsteczek związanych z błoną, ale także usuwają wodę związaną z makrocząsteczkami, takimi jak DNA. Utrata wody z komórek zmniejszy ich rozmiar i zwiększy ich gęstość, wpływając tym samym na ich pływalność i szybkość sedymentacji. Efekt osmotyczny na komórkach i makrocząsteczkach może być odwracalny, choć jest to możliwe źródło błędu, którego należy unikać.

Na przestrzeni lat opracowano wiele różnych związków jako nośniki gradientu gęstości w celu usprawnienia procesu separacji i przezwyciężenia problemów związanych z osmolalnością i lepkością. Istnieje pięć głównych klas nośników gradientu gęstości:

• Alkohole wielowodorotlenowe (cukrowe)
• Polisacharydy
• Sole nieorganiczne
• Związki jodowane
• Krzemionka koloidalna

Tabela 1Rodzaje nośników z gradientem gęstości i ich główne zastosowania.

.

Tabela wyboru

.

1. Graham J. 2001. Biological Centrifugation. BIOS Scientific Publishers.

2. Sharpe PT. 2012. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Methods of Cell Separation. 18. Elsevier.