Pakowanie kolumn i przygotowanie do chromatografii powinowactwa przeciwciał

Prepakowane kolumny firmy Cytiva zapewnią powtarzalne wyniki i najwyższą wydajność.

Używaj małych, wstępnie zapakowanych kolumn do badania mediów chromatograficznych i optymalizacji metod oraz w celu zwiększenia wydajności w opracowywaniu metod.

Efektywne upakowanie kolumny ma zasadnicze znaczenie dla separacji AC, szczególnie w przypadku stosowania elucji gradientowej. Źle upakowana kolumna powoduje słaby i nierównomierny przepływ, poszerzenie pasma i utratę rozdzielczości. Jeśli wymagane jest upakowanie kolumny, poniższe wytyczne będą miały zastosowanie we wszystkich skalach działania:

• W przypadku medium o wysokiej zdolności wiązania, użyj krótkich, szerokich kolumn (zwykle o wysokości złoża od 5 do 15 cm) do szybkiego oczyszczania, nawet przy niskiej prędkości przepływu.
• Ilość wymaganego medium AC będzie zależeć od zdolności wiązania medium i ilości próbki. Zdolności wiązania dla każdego medium są podane w niniejszym podręczniku i dostarczane wraz z instrukcjami dotyczącymi produktu. Oszacuj ilość pożywki wymaganą do związania próbki będącej przedmiotem zainteresowania i użyj pięciokrotności tej ilości do wypełnienia kolumny. Ilość wymaganego medium można zmniejszyć, jeśli rozdzielczość jest zadowalająca.
• Po określeniu parametrów separacji, zwiększ skalę oczyszczania, zwiększając średnicę kolumny, aby zwiększyć jej objętość. Unikaj zwiększania długości kolumny, jeśli to możliwe, ponieważ zmieni to warunki separacji.

ŚrodkiAC mogą być pakowane w kolumny Tricorn, XK lub HiScale^® dostępne w firmie Cytiva (Rysunek A5.1).

Rysunek A5.1. Trwa pakowanie kolumn.

1. Wyrównać wszystkie materiały do temperatury, w której będzie przeprowadzana separacja.
2. Eliminować powietrze przez przepłukanie końcówek kolumny zalecanym buforem. Upewnij się, że powietrze nie jest uwięzione pod siatką kolumny. Zamknąć wylot kolumny, pozostawiając 1 do 2 cm buforu w kolumnie.
3. Delikatnie ponownie zawiesić pożywkę.

Uwaga: pożywki AC firmy Cytiva są dostarczane w postaci gotowej do użycia. Dekantacja fizyn, które mogłyby zatkać kolumnę, nie jest konieczna.

Unikaj używania mieszadeł magnetycznych, ponieważ mogą one uszkodzić matrycę chromatograficzną.

4. Oszacuj wymaganą ilość zawiesiny (ponownie zawieszonego medium) na podstawie zaleceń zawartych w instrukcji obsługi.
5. Wlej wymaganą objętość zawiesiny do kolumny. Nalewanie za pomocą szklanego pręta przyłożonego do ściany kolumny zminimalizuje wprowadzanie pęcherzyków powietrza.
6. Natychmiast napełnij kolumnę buforem.
7. Zamontuj górną część kolumny/adapter i podłącz do pompy.
8. Otwórz wylot kolumny i ustaw pompę na żądaną szybkość przepływu (na przykład 15 ml/min w kolumnie XK 16/20).

Gdy objętość zawiesiny jest większa niż całkowita objętość kolumny, podłącz drugą szklaną kolumnę, aby działała jako zbiornik (szczegółowe informacje znajdują się w części Informacje o zamawianiu). Zapewnia to, że zawiesina ma stałą średnicę podczas pakowania, minimalizując turbulencje i poprawiając warunki pakowania kolumny.

Jeśli nie można uzyskać zalecanej szybkości przepływu, należy użyć maksymalnej szybkości przepływu, jaką może zapewnić pompa.

9. Utrzymać szybkość przepływu pakowania przez co najmniej 3 CV po uzyskaniu stałej wysokości złoża. Zaznaczyć wysokość złoża na kolumnie.

Nie przekraczać 70% szybkości przepływu wypełnienia podczas oczyszczania.

10. Zatrzymać pompę i zamknąć wylot kolumny. Jeśli została użyta druga kolumna: Zdejmij górną część i ostrożnie wypełnij resztę kolumny buforem, aby utworzyć menisk u góry. Włóż adapter do kolumny pod kątem, upewniając się, że powietrze nie jest uwięzione pod siatką.
11. Przesuń adapter powoli w dół kolumny (wylot adaptera powinien być otwarty), aż do osiągnięcia znaku. Zablokuj adapter w odpowiedniej pozycji.
12. Podłącz kolumnę do pompy i rozpocznij wyrównywanie. W razie potrzeby zmień położenie adaptera.

Podłoże musi zostać dokładnie wypłukane w celu usunięcia roztworu do przechowywania, zwykle 20% etanolu. Pozostałości etanolu mogą zakłócać kolejne procedury.

Wiele pożywek chromatograficznych wyrównanych sterylną solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą środek przeciwdrobnoustrojowy może być przechowywanych w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca, ale zawsze należy postępować zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami przechowywania dostarczonymi z produktem.

Pakowanie i wydajność kolumny

Wydajność kolumny wyrażana jest jako liczba płytek teoretycznych na metr złoża chromatograficznego (N) lub jako H (wysokość równoważna płytce teoretycznej, HETP), która jest długością złoża (L) podzieloną przez liczbę płytek. Wydajność kolumny jest związana z poszerzeniem pasma, które może wystąpić na kolumnie i może być obliczona z wyrażenia:

N = 5.54 × (

VR -- Wh

)2

V_R = objętość eluowana od początku nanoszenia próbki do maksimum piku
w_h = szerokość piku mierzona jako szerokość zarejestrowanego piku w połowie wysokości piku

H oblicza się z wyrażenia:

H =

L N

L = wysokość upakowanego złoża.

Pomiary V_R i w_h mogą być wykonane w odległości (mm) lub objętości (mL), ale oba parametry muszą być wyrażone w tej samej jednostce.

Wydajność kolumny powinna być sprawdzana w regularnych odstępach czasu poprzez wstrzykiwanie acetonu w celu określenia wydajności kolumny (N) i symetrii piku (współczynnik asymetrii, A_s). Ponieważ obserwowana wartość N zależy od czynników eksperymentalnych, takich jak szybkość przepływu i obciążenie próbki, porównania należy przeprowadzać w identycznych warunkach. W AC wydajność jest mierzona w warunkach izokratycznych poprzez wstrzyknięcie acetonu (który nie wchodzi w interakcje z medium) i pomiar eluowanego piku, jak pokazano na Rysunku A5.2.

.

Rysunek A5.2. Pomiary wykonane w celu obliczenia wydajności kolumny.

Zgodnie z ogólną zasadą, dobra wartość H jest około dwa do trzech razy większa od średniej średnicy cząstek upakowanego medium. Dla cząstki 90 µm oznacza to wartość H od 0,018 do 0,027 cm.

Współczynnik asymetrii (A_s) wyraża się jako:

As =

b a

gdzie

a = szerokość pierwszej połowy piku przy 10% wysokości piku
b = szerokość drugiej połowy piku przy 10% wysokości piku

Wartość A_s powinna być jak najbliższa 1,0. Rozsądna wartość A_s dla krótkiej kolumny używanej w AC wynosi od 0,80 do 1,80.

Rozległa krawędź wiodąca jest zwykle oznaką, że medium jest upakowane zbyt ciasno, a rozległy ogon jest zwykle oznaką, że medium jest upakowane zbyt luźno.

Przeprowadź co najmniej 2 CV buforu przez nowo zapakowaną kolumnę, aby upewnić się, że medium jest wyrównane z buforem startowym.

Pakowanie kolumn na zamówienie

Usługa pakowania kolumn laboratoryjnych lub wypełniania 96-dołkowych płytek jest świadczona, gdy kolumny lub płytki z odpowiednimi mediami chromatograficznymi nie są dostępne w standardowym portfolio. Grupa produktów niestandardowych ściśle współpracuje z klientem w celu dostarczenia zapakowanych kolumn spełniających specjalistyczne wymagania w zakresie oczyszczania.

Wybór kolumn

Kolumny Tricorn, XK i HiScale^® są w pełni kompatybilne z wysokimi prędkościami przepływu dozwolonymi przez nowoczesne nośniki i dostępny jest szeroki zakres wymiarów kolumn (Tabela A5.1).

W większości przypadków zdolność wiązania medium i ilość próbki do oczyszczenia określą wymagany rozmiar kolumny. Dostępne są również puste jednorazowe kolumny PD-10 do zastosowań jednorazowych z przepływem grawitacyjnym.

Tabela A5.1 Objętość i wysokość złoża kolumnowego1

	Rozmiar kolumny	Pojemność łóżka (mL)	Wysokość łóżka (cm)
i.d. (mm)	Długość
Tricorn 5/20	5	20 mm	0.3 do 0,5	1,6 do 2.8
Tricorn 5/50	5	50 mm	0.9 do 1.1	4.6 do 5,8
Tricorn 10/20	10	20 mm	1.2 do 2,2	1,6 do 2,8
Tricorn 10/50	10	50 mm	3,6 do 4.5	4,6 do 5,8
Tricorn 10/100	10	100 mm	7.5 do 8,5	9,6 do 10.8
XK 16/20	16	20 cm	5.0 do 31.1	2,5 do 15,5
XK 16/40	16	40 cm	45.2 do 70,3	22,5 do 35.0
XK 26/20	26	18 cm	5.3 do 66.3	1.0 do 12,5
XK 26/40	26	40 cm	122.1 do 185,7	23,0 do 35.0
XK 50/20	50	18 cm	0 do 274.8	0 do 14.0
XK 50/30	50	30 cm	274.8 do 549,5	14,0 do 28.0
HiScale® 16/20	16	200 mm	0 do 40.2	0 do 20,0
HiScale® 16/40	16	400 mm	16.1 do 80,4	8.0 do 40.0
HiScale® 26/20	26	200 mm	0 do 106.1	0 do 20.0
HiScale® 26/40	26	400 mm	69.0 do 212,3	13,0 do 40.0
HiScale® 50/20	50	200 mm	0 do 392.5	0 do 20.0
HiScale® 50/40	50	400 mm	274.8 do 785,0	14,0 do 40.0
Pusty jednorazowy PD-102	15	7,4 cm	8.3	4,8 do 5,0
1 Tricorn i XK, specyfikacje kolumn mają zastosowanie, gdy używany jest jeden adapter. W przypadku HiScale® specyfikacje kolumn mają zastosowanie, gdy używane są dwa adaptery. 2 Do zastosowań z przepływem grawitacyjnym. Wraz ze zbiornikiem buforowym LabMate (patrz informacje dotyczące zamawiania) można zastosować do 25 ml buforu i/lub próbki, co znacznie skraca czas obsługi.

Czyszczenie podłoży sefarozowych Protein G i Protein A

Po oczyszczeniu podłoże należy zregenerować w następujący sposób:

1. Po elucji przemyć 2 do 3 objętościami buforu elucyjnego.
2. Natychmiast ponownie wyrównać, przemywając 2 do 3 objętościami buforu wiążącego.

Czyszczenie na miejscu

Gdy zaobserwowany zostanie wzrost ciśnienia wstecznego, podłoże powinno zostać oczyszczone. W niektórych zastosowaniach substancje takie jak zdenaturowane białka lub lipidy nie ulegają elucji w procedurze regeneracji.

Aby usunąć wytrącone lub zdenaturowane białka:

1. Przepłukać medium 2 objętościami 6 M chlorowodorku guanidyny.
2. Natychmiast przemyć co najmniej 5 objętościami kolumny buforu wiążącego.

Aby usunąć silnie związane białka hydrofobowe, lipoproteiny i lipidy:

1. Przemyć niejonowym detergentem, na przykład 0.1% Triton X-100 w temperaturze 37 °C przez 1 min.
2. Natychmiast przemyj kolumnę co najmniej 5 objętościami sterylnego buforu wiążącego.
   a) Alternatywnie przemyj kolumnę 70% etanolem i pozostaw na 12 godzin.

Po obróbce przemyć co najmniej 5 objętościami buforu wiążącego.

Odwrócony przepływ może poprawić wydajność procedury czyszczenia na miejscu. Po czyszczeniu przechowywać w 20% etanolu.

Mycie 70% etanolem zwiększy ciśnienie wsteczne. Podczas czyszczenia z użyciem 70% etanolu należy stosować niższy przepływ.

Czyszczenie nośników MabSelect

Wszystkie nośniki MabSelect mogą być czyszczone przy użyciu następujących procedur:

Aby usunąć wytrącone lub zdenaturowane substancje:

1. Umyć pożywkę 2 objętościami kolumnowymi 50 mM wodorotlenku sodu w 500 mM siarczanie sodu, lub 50 mM wodorotlenku sodu w 1 M chlorku sodu, lub 100 mM fosforanu sodu, lub 6 M chlorowodorku guanidyny w 10 mM wodorotlenku sodu. Czas kontaktu: co najmniej 10 min.
2. Natychmiast przemyć co najmniej 5 objętościami sterylnego buforu wiążącego o pH 7,0 do 8,0.

MabSelect SuRe i MabSelect SuRe LX są tolerancyjne na alkalia, co pozwala na stosowanie bardziej stężonych roztworów wodorotlenku sodu:

1. Płukać 3 objętościami kolumny buforu wiążącego.
2. Płukać co najmniej 2 objętościami kolumny wodorotlenku sodu o stężeniu od 100 mM do 500 mM. Czas kontaktu: 10 do 15 min.
3. Natychmiast przemyć co najmniej 5 objętościami sterylnego i filtrowanego buforu wiążącego o pH 7,0 do 8,0.

Aby usunąć silnie związane hydrofobowe białka, lipoproteiny i lipidy:

1. Przepłukać 2 objętościami kolumny niejonowym detergentem (np. 0,1% roztworem), 0,1% roztwór).
2. Natychmiast przemyć co najmniej 5 objętościami kolumny sterylnego buforu wiążącego o pH 7,0 do 8,0.
   a)  Alternatywnie przemyć 3 do 4 objętościami kolumny 70% etanolu lub 30% 2-propanolu. Natychmiast przepłukać co najmniej 5 objętościami kolumny sterylnego buforu wiążącego o pH od 7,0 do 8,0. Zastosuj rosnące gradienty, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas stosowania wysokich stężeń rozpuszczalników organicznych.

Płukanie 70% etanolem i 30% 2-propanolem zwiększy ciśnienie wsteczne. Podczas czyszczenia z użyciem 70% etanolu lub 30% 2-propanolu należy stosować niższe natężenie przepływu.