Podstawy wirowania

Poczytaj o

• Naturalne siły grawitacyjne i wirowanie
• Zachowanie i separacja cząstek
• Względna siła odśrodkowa
• Nomogram wirowania przy niskiej prędkości
• Instrukcje dotyczące nomogramu
• Wirowanie w gradiencie gęstości
• Podłoża o gradiencie gęstości
• Powiązane produkty

Naturalne siły grawitacyjne i wirowanie

Siła grawitacji Ziemi jest wystarczająca do rozdzielenia wielu rodzajów cząstek w czasie. Probówka z antykoagulowaną krwią pełną pozostawiona na blacie stołu ostatecznie rozdzieli się na osocze, czerwone krwinki i frakcje białych krwinek. Jednak wymagany czas wyklucza ten sposób separacji dla większości zastosowań.

W praktyce siła odśrodkowa jest niezbędna do oddzielenia większości cząstek. Ponadto potencjalna degradacja związków biologicznych podczas długotrwałego przechowywania oznacza, że potrzebne są szybsze techniki separacji.

Wirowanie jest jednym z najbardziej podstawowych zastosowań laboratoryjnych i jest wykorzystywane przez szeroki zakres personelu klinicznego i badawczego. Zasadniczo wirowanie polega na oddzielaniu cząstek poprzez sedymentację. Chociaż sedymentacja przy użyciu wirowania nie jest nową technologią, jest ona niezbędna do najnowocześniejszych badań genomicznych i proteomicznych poprzez dostarczanie oczyszczonych cząstek będących przedmiotem zainteresowania.

Szybkość separacji w zawiesinie cząstek za pomocą siły grawitacji zależy głównie od wielkości i gęstości cząstek. Cząstki o większej gęstości lub większym rozmiarze zazwyczaj poruszają się szybciej i w pewnym momencie zostaną oddzielone od cząstek o mniejszej gęstości lub mniejszych. Ta sedymentacja cząstek, w tym komórek, może być wyjaśniona przez prawo Stoke'a, które opisuje ruch kuli w polu grawitacyjnym.¹ Równanie oblicza prędkość sedymentacji przy użyciu pięciu parametrów (Rysunek 1).

Rysunek 1. Równanie prawa Stoke'a.

Zachowanie i separacja cząstek

Na podstawie równania Stokesa można wyjaśnić pięć ważnych zachowań cząstek:

1. Szybkość sedymentacji cząstek jest proporcjonalna do ich wielkości.
   
2. Szybkość sedymentacji jest proporcjonalna do różnicy gęstości między cząstką a medium.
   
3. Szybkość sedymentacji wynosi zero, gdy gęstość cząstki jest taka sama jak gęstość medium.
   
4. Szybkość sedymentacji maleje wraz ze wzrostem lepkości ośrodka.
   
5. Szybkość sedymentacji rośnie wraz ze wzrostem siły grawitacji.

Relative Centrifugal Force

Większość cząstek jest tak mała, że siła grawitacji jest niewystarczająca do pokonania przypadkowych sił molekularnych cząstek, aby wpłynąć na separację. Wirowanie, nazwa nadana aplikacjom separacji, które obejmują wirowanie wokół osi w celu wytworzenia siły odśrodkowej, jest sposobem na zwiększenie wielkości pola grawitacyjnego. Cząstki w zawiesinie doświadczają promieniowej siły odśrodkowej, która odsuwa je od osi obrotu.²

Siła promieniowa generowana przez wirujący wirnik jest wyrażana w stosunku do ziemskiej siły grawitacji i dlatego jest znana jako względna siła odśrodkowa (RCF) lub "siła g".Siła g działająca na cząsteczki jest wykładnicza w stosunku do prędkości obrotowej (zdefiniowanej jako obroty na minutę; rpm).

Podwojenie prędkości obrotowej zwiększa siłę odśrodkową czterokrotnie. Siła odśrodkowa wzrasta również wraz z odległością od osi obrotu. Te dwa parametry mają istotne znaczenie przy wyborze odpowiedniej wirówki. Tabela 1 podsumowuje zastosowania, które można sklasyfikować według względnej siły odśrodkowej.³

Tabela 1. Klasy wirówek i ich zastosowania.

Parametry	Niska prędkość	Wysoka prędkość	Ultracentrifuge
Zakresy prędkości (obr.p.m. x 103)	2-6	18-22	35-120
Maksymalny RCF (x 103)	8	60	700
Pelleting Applications
Bakterie	-	Tak	Tak*
Komórki zwierzęce i roślinne	Tak	Tak	Tak*
Jądra	Tak	Tak	Tak*
Wytrącenia	niektóre	większość	tak*
Organelle błonowe	Niektóre	Tak	Tak
Frakcje błonowe	Niektóre	Niektóre	Tak
Rybosomy/polisomy	-	-	Tak
Makrocząsteczki	-	-	Tak
Wirusy	-	Najwięcej	Tak

* Można to zrobić, ale zwykle nie jest to wykorzystywane do tego celu.

RCF zależy od prędkości obrotowej w obr/min i odległości cząstek od środka obrotu. Gdy prędkość obrotowa jest podana w obrotach na minutę (Q), a odległość (r) jest wyrażona w centymetrach, RCF można obliczyć za pomocą wzoru na Rysunku 2.

.

Rysunek 2. Wzór na względną siłę odśrodkową (RCF).

Nomogram wirowania z niską prędkością./h2>

Nomogram może być również użyty do uzyskania prędkości wirnika wirówki niezbędnej do uzyskania pożądanego RCF (Rysunek 3). To szybkie oszacowanie jest przydatne w przypadku wirowania z niską prędkością. Jednak dokładniejsze jest użycie obliczeń RCF dla prędkości przekraczających 10 000 obr.

Rysunek 3. Nomogram do szacowania prędkości obrotowej wirówki.

Instrukcje dotyczące nomogramu

1. Zmierz promień (cm) od środka wirnika wirówki do końca nośnika probówki.
   
2. Uzyskaj względną siłę odśrodkową niezbędną do zastosowania.
   
3. Linia prosta łącząca wartość promienia z wartością względnej siły odśrodkowej (g) umożliwi odczytanie prędkości wirnika (rpm) z prawej kolumny.

Density Gradient Centrifugation

Wirowanie w gradiencie gęstości to technika, która pozwala na oddzielenie cząstek na podstawie ich wielkości, kształtu i gęstości. Gradient gęstości jest zwykle tworzony przez nakładanie warstw mediów o rosnącej gęstości w probówce wirówki. Gdy próbka jest nakładana na gradient gęstości i odwirowywana, różne cząstki przemieszczają się przez gradient z różną prędkością. Cząstki pojawiają się jako pasma lub strefy w gradiencie, przy czym gęstsze i większe cząstki migrują najdalej.

Nośniki gradientu gęstości

Badano wiele różnych związków jako nośniki gradientu gęstości. Jedna z pierwszych technik wirowania w gradiencie gęstości została opracowana w latach pięćdziesiątych XX wieku i wykorzystywała buforowany roztwór sacharozy do oczyszczania organelli komórkowych. Sacharoza szybko stała się preferowanym medium do oddzielania homogenizowanych tkanek ssaków. Później gradienty chlorku cezu zostały użyte do oddzielenia DNA o różnych gęstościach. Meselson i Stahl w 1958 roku wykorzystali wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu w eleganckim eksperymencie, aby wesprzeć półkonserwatywny model replikacji DNA. Zawiesiny krzemionki koloidalnej zostały po raz pierwszy wyprodukowane przez firmę DuPont i sprzedawane pod nazwą LUDOX^®.⁴

W 1977 roku stabilizowany koloid krzemionkowy pokryty poliwinylopirolidonem (PVP) o nazwie Percoll^® stał się dostępny do oddzielania komórek i cząstek subkomórkowych. W 1968 roku Boyum opisał metody izolacji komórek jednojądrzastych z krwi krążącej i szpiku kostnego przy użyciu mieszanin polisacharydu i nieprzepuszczalnego dla promieni rentgenowskich środka kontrastowego. Doprowadziło to do opracowania pierwszej niejonowej jodowanej pożywki gradientu gęstości, metrizamidu, w latach siedemdziesiątych XX wieku.⁵ Obecnie dostępny jest duży wybór komercyjnych jodowanych pożywek gradientu gęstości.

Referencje

1. Sharpe PT. 2012. Methods of Cell Separation. Elsevier Science.

2. Graham J. 2001. Biological Centrifugation. 1. Garland Science.

3. Rickwood D, Ford T, Steensgaard J. 1994. Centrifugation: Essential Data. Wiley.

4. Rickwood D. 1984. Centrifugation: A Practical Approach. 2. Oxford University Press.

5. Rickwood D. 1983. Iodinated Density Gradient Media, A Practical Approach. Oxford University Press.